红细胞凝聚试验.doc

红细胞凝聚试验（HA）与红细胞凝聚抑制试验（HI）
用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。但鸡群免疫抗体的产生和维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。因而通过对鸡群进行抗体检测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫现象。因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。
一、 实验用设备
1、 离心机1台（3000转，离心红细胞）
2、 冰箱1台（存放抗原）
3、 震荡器1台（震荡96孔V型板）
4、 抗原 新城疫ND、减蛋EDS、流感AI抗原，从正规厂家进。
5、 96孔V型板 稀释血清 清洗后可重复使用
6、 八道移液器 1把 （5-50微升 稀释血清）
7、 吸头和八道移液器配套使用，（清洗后重复使用）
8、 积液槽 配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用
9、 一次性采血管 采血用
10、 2ml注射器 采血用
11、 红细胞 非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用
12、 柠檬酸三钠 配制3.8%抗凝剂用
13、 重铬酸钾 配制清洁液用
14、 硫酸 配制清洁液用
15、 吸管 1ml、10ml
16、 吸耳球 和吸管配套使用
17、 针头9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）
18、 蒸馏水 当地买。清洗96孔V型板、吸头用
19、 10ml离心管 离心红细胞用（塑料制）
20、 生理盐水 做血清稀释液用，配制4单位抗原
二、 实验前的准备
1、抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
2、抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
3、1%红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血=1：2的比例），迅速混匀。在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4~5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。现用现配。
4、被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5—1ml，静置或离心，待血清析出后备用。
5、吸管清洁液的配置：使用1%的稀硫酸溶液。水10公斤，硫酸100ml，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅拌，操作时必须戴手套，口罩。
6、96孔V型板和微量滴头清洁液的配置：重铬酸钾79克，水1000ml，硫酸100ml，将重铬酸钾磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸100ml，不断搅拌，切不可将重铬酸钾水溶液倒入硫酸中，以防爆炸，操作时必须戴手套，口罩。
7、血清稀释液：为灭菌的生理盐水。
二、实验过程：
原理：某些病毒（如新城疫、减蛋、流感）能够与鸡红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验（HI）。
应用1、检测血清中的抗体水平，确定免疫时机。2、免疫后及时监测，确认免疫效果。3、辅助诊断病毒性疾病。
（一）血凝（HA）试验：采用96孔V型反应板，测定抗原效价。
1、首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25微升。
2、用微量移液器吸取待测抗原25微升于第一孔中并挤压6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25微升。
3、微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25微升。
4、置于微量震荡器上震荡1分钟。
5、室温静置30分钟后观察结果。
6、结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔内的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如彩图1所示第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1：256。
表1： HA试验
孔号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
病毒稀释倍数
1：2
1：4
1：8
1：16
1：32
1：64
1：128
1：256
1：512
1：1024
1：2048
对照
（二）4单位抗原校正：
1、 根据抗原效价结果配置相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原。
例：上图1：抗原效价为1：256，HI试验时，25微升抗原稀释液内须含4个凝集单位，则应将抗原作256/4=64倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理盐水。
2、首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升。第一孔不加。
3、用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25微升。
4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1—6孔，每孔25微升。
5、于微量振荡器上振荡1分钟。
6、室温静置30分钟后观察结果。
7、结果观察：第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。如彩图2所示。
表：2： 4单位抗原校正
孔号
1
2
3
4
5
6
抗原稀释液
4单位
2单位
1单位
0.5单位
对照
对照
图2 前三孔为红细胞完全凝集，第四孔为红细胞50%凝集，第五孔为红细胞完全凝集，说明该次抗原校正成立。
（三）血凝抑制（HI）试验：每排孔检查1分血清。步骤如下：
1、 用微量移液器先加25微升生理盐水于各孔中。
2、 用微量移液器吸取待检血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25微升。最后一孔不稀释，为红细胞对照。
3、 用微量移液器吸取配置好的抗原，每孔25微升。
4、 置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
5、 室温静置20分钟。
6、 用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25微升。
7、 置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
8、 室温静置40分钟后观察结果。
三、结果判定；
（1） 判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血清稀释度为该血清的HI滴度，以2的指数表示。见彩图3：
（2） 判定标准：
1、 新城疫抗体：育雏育成鸡在7以上，产蛋鸡在9以上。
2、 H5抗体：抗体值在6以上。
3、 H9抗体：抗体值在7以上。
注：低于以上标准，则需要进行免疫。
（3） 免疫后抗体规律：
一般活疫苗免后7—10天产生抗体，2—3周抗体到达峰值，可以维持2个月。灭活疫苗免后10—15天产生抗体，3—4周抗体到达峰值，可以维持3—4个月。
四、实验后的用具处理：
1、96孔V型反应板的清洗：
新反应板可直接放入清洁液中浸泡24小时，用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物，然后泡在清洁液中，24小时后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中，烤干备用。属塑料制品，70℃以下烤干。
2、 微量滴头的清洗：
新滴头直接放入清洗液中浸泡，用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡在清洁液中，最少浸泡24小时，捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液，然后在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，放入恒温箱中烤干，备用。属塑料制品，70℃以下烤干。
3、 吸管及滴头的清洗：
将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中，24小时后捞出，用流动水冲洗干净后在蒸馏水中再冲洗一遍，甩干，吸管放入高温干燥箱中160℃干燥1—2小时后备用，玻璃制品可高温烤干。积液槽放入恒温箱中烘干。