转氨酶、硝态氮、铵态氮等测定方法.doc

六、 氮含量（硝酸盐、亚硝酸盐、游离氨基酸、铵态氮等）的测定：（2g）
样品提取液的提取: 称取新鲜植物组织2g，加入15ml无离子水研磨成匀浆，置于45℃振荡机中摇动浸提（或超声波）lh后用5ml无离子水冲洗干净，然后离心或过滤(如含色素需用活性炭脱色)，滤液备用。
备注（lg的经验）：可溶性糖、可溶性蛋白质、VC等需要研磨提取的简单指标也可以使用此提取液按比例测定。

1硝态氮的测定：
标准氮试剂：精称KNO3 0.9021g，溶于少量重蒸无离子水中，并定容至250ml，含N 量为500µgNO3一N／ml。
5％水杨酸一硫酸溶液：称取水杨酸5g，溶于100ml浓H2SO4(比重1．84)中，搅拌溶解后贮于棕色瓶内，冰箱中至多保存l周，最好现用现配。
 2mol／L NaOH溶液：称取NaOH 80g放入500ml硬质烧杯中，加入重蒸无离子水200ml，溶解后定容至l000ml。
操作方法
标准曲线制作取：50ml容量瓶6只(编号)，依次加入标准氮试剂5、l0、l5、20、25、30ml，用无离子水定容，则成为50、100、l50、200、250、300 ug／ml的氮系列标准溶液；再取干沽50ml三角瓶7只，分别装入上述系列溶液0．2ml，剩下的1只三角瓶加入无离水0.2ml(作为O 点)；然后分别加入5％水杨酸一硫酸溶液0.8ml，混匀静置20--30min(显色)；最后加入2mol／L NaOH溶液l9ml，混匀。冷却后利用751分光光度计，于410nm下比色，记录光密度(OD)值；并以OD 值为纵座标，以标准氮(0、50、l00、150、200、250、300 ug)为横座标，绘制一条标准曲线(通过原点的直线)。
0.1ml滤液＋0.4ml 5％水杨酸一硫酸溶液，混匀静置20--30min(显色)；最后加入2mol／L NaOH溶液9.5ml，混匀。冷却后利用751分光光度计，于410nm下比色，记录光密度(OD)值；结果计算
按照公式A= CV1/(WV2) 计算。
式中：A—NO3一N含量(ug／g)；W一样品重(g)；V1一样品提取液总量(m1)：V2一样品反应液数量(m1)；C一样品在标准曲线上查得的N量(ug)：
2亚硝态氮的测定：
NaN02 标准溶液：精称分析纯NaNO2 0.24643g，以无离子水溶解并定容至50ml,再吸取此溶液5ml定容至l000ml，作为母液，其浓度为5µgNO2一N／ml。
磺胺试剂：称取分析纯磺胺(或对氨基苯磺酸)l0g，加浓HCI 250ml(需用水浴加热溶解)，用无离子水定容至lL。
ɑ一萘胺试剂：称取分析纯ɑ一萘胺2g，加浓HCI 250ml，溶解后定容至1L。
操作方法
标准曲线绘制：取干沽试管6支(0～5号)，依次加入标准NaNO2母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，再依次加入无离子水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml：摇匀后再在各管分别加入磺胺试剂和ɑ一萘胺试剂各2ml：摇匀后于35"(2水浴中显色30min，于520ml处比色，绘制出标准曲线。
lml样品提取液＋2ml磺胺试剂＋2mlɑ一萘胺试剂，摇匀后于35℃水浴中显色30min，于520ml处比色。
结果计算
按照公式A= CV/W计算。
式中：A— N02一N 含量(µg/g)：
C一查标准曲线值(µg)；
v一样品提取液总量(ml)；
W一样品重(g)

3 游离氨基酸态氮的测定：
试剂：（1）乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.4）：称取乙酸钠54.4g放入100ml烧杯，加无氨蒸馏水到60ml刻度，水浴锅加热搅拌溶解。冷却后转入100ml容量瓶中加30ml冰醋酸，再用无氨蒸馏水稀释至100ml。
（2）水合茚三酮试剂：称取3.0g再结晶的茚三酮置烧杯中，加入75ml正丙醇，搅拌使其溶解。再加入150ml正丁醇及300ml乙二醇，最后加入45ml pH 5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置4℃下保存备用，10天内有效。
（3）标准氨基酸：称取80℃下烘干的亮氨酸46.8mg，溶于少量10%异丙醇中，用10%异丙醇定容至100ml。取此液5ml，用蒸馏水稀释至50ml，即为含5μg/ml 氨基氮的标准液。
（4）0.1%抗坏血酸：称取50mg 抗坏血酸，溶于50ml无氨蒸馏水中，随配随用。
（5）10%乙酸。
样品制备
取新鲜植物样品，洗净，擦干并剪碎。混匀后，迅速称取0.5-1.0g，于研钵中加入5ml 10%乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至100ml。混匀，并用滤纸过滤到三角瓶中备用。
制作标准曲线
取6支20ml 刻度试管，按表操作

加完试剂后混匀，盖上大小合适的玻璃球，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而退去，进而呈蓝紫色时，加60%乙醇4.9ml。混匀后用1cm光径比色皿在570nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
样品测定
吸取样品滤液1.0ml，放入干燥试管中，加无氨蒸馏水1.0ml，其他步骤与制作标准曲线相同。根据样品吸光度在标准曲线上查的含氮量。
按下式计算样品中氨基态氮的含量

式中：C为标准曲线上查的的氨基态氮含量，μg；VT为样品稀释总体积，ml；Vs 为测定时样品体积，ml；W为样品鲜重，g。
附注：（1）茚三酮重结晶的方法：合格的茚三酮应该是微黄色结晶，若保管不当，颜色加深或变成微红色，必须重结晶后方可使用。其方法如下：5g茚三酮溶于15ml水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，溶液太稠时，可适量加水，30min后用滤纸过滤，滤液置冰箱中过夜后即可见微黄色结晶析出，用干滤纸过滤，再用1ml蒸馏水洗结晶一次，置于干燥器中干燥后贮于棕色瓶中。
（2）茚三酮与氨基酸反应生成的Ruhemans紫在1小时内保持稳定，故稀释后尽快比色。
（3）空气中的氧干扰显色反应的第一步。以抗坏血酸为还原剂，可提高反应的灵敏度，并使颜色稳定，但由于抗坏血酸也可以与茚三酮反应，使溶液颜色过深，故应严格掌握加入抗坏血酸的量。
（4）反应温度影响显色稳定性，超过80℃，溶液易褪色；可在80℃水浴中加热，并适当延长反应时间，效果良好。

4、铵态氮测定
1、试剂配制
（1）苯酚溶液: 称取苯酚5g，亚硝基铁氰化钠50mg ，用蒸馏水溶解后转移至500mL容量瓶并定容，用棕色瓶 4℃冰箱保存。用时须温热至室温。注意硝普钠有剧毒！！！
（2）次氯酸钠碱性溶液： 称取氢氧化钠5g ，磷酸氢二钠3.53g ，磷酸钠15.9g，量取次氯酸钠[ω（NaOCl）=5.25%，即含有效氯5%的漂白剂溶液]溶液5mL ，溶解后转移至500mL容量瓶后定容，棕色瓶4℃冰箱保存。
（3）0.3mmol/L的硫酸溶液: 量取8.1ml浓硫酸稀释，定容到500ml。
（4）掩蔽剂： 酒石酸钾钠溶液[ρ（KNaC4H4O6·4H2O）=400g·L-1]与EDTA二钠溶液[ρ（C10H14O8N2Na2）=100g·L-1]等体积混合，每100mL混合液中加0.5mLNaOH溶液[c(NaOH)=10mol·L-1]，即得清亮的掩蔽剂溶液。
适用方法：称量20g酒石酸钾钠、5gEDTA二钠、0.2gNaOH于烧杯中，加约60ml水加热溶解，转移至100ml容量瓶中定容。
（4）铵态氮标准储备液[ρ（N）=100µg·mL-1]： 称取0.4717g于105℃±2℃烘2h的硫酸铵[（NH4）2SO4，优级纯]溶于水，定容至1L。
（5）铵态氮标准溶液[ρ（N）=5µg·mL-1]： 测定当天将铵态氮标准贮备液用水准确稀释20倍（例如5.00mL稀释至100mL）

2、分析步骤：
（1）标准曲线制作：
吸取铵态氮标准溶液，按下面表格操作：
试剂
管号
1
2
3
4
5
6
7
标准铵态氮/ml
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
无铵蒸馏水/ml
3.0
2.9
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
苯酚溶液/ml
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
次氯酸钠碱性溶液/ml
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
铵态氮含量/µg
0
0.5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
摇匀，在20℃左右室温下放置30min，加0.1ml掩蔽剂，再加5.9ml无铵蒸馏水
之后，用1cm比色皿在625nm波长处进行比色。用系列溶液的零浓度为空白进行比色，测定吸光值，绘制浓度-吸光度标准曲线。

（2） 样品测定
称取0.5g样品到研钵中，用5.0ml无氨蒸馏水研磨，转入离心管中，12500rpm离心15min，吸取0.1ml上清液稀释到试管中，依次加入2.9ml无氨蒸馏水、0.5mL酚溶液和0.5mL次氯酸钠碱性溶液，摇匀，在20℃左右室温下放置30min。加入0.1mL掩蔽剂以溶解可能生成的沉淀物，然后加蒸馏水5.9ml，摇匀后以0.30 mmol/L的硫酸为对照用1cm比色皿在625nm波长处进行比色。使用μmol.g-1.FW表示。
3、注意事项：
显色液在常温下放置30min后再加入掩蔽剂，过早加入会使显色反映很慢，蓝色偏弱；过晚加入，则生成的氢氧化物成的氢氧化物沉淀可能老化而不易溶解。

转氨酶、硝态氮、氨基酸态氮等测定方法
转氨酶（谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)的测定：（2g样）（参考吴良欢等的《植物转氨酶（GOT和GPT）活度比色测定方法及其应用》）
O.05mol/L Trs—HCL缓冲液(pH7．2)：0.2mol／L 三羟甲基氨基甲烷(30.25g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至200m1)200ml和0.2mol/L HC1 221ml，用蒸馏水稀释至1000ml。
0．1mol／L磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠(AR)11.928g，磷酸二氢钾(AR)2.176g，加少量蒸馏水溶解并定容至1000ml。
2，4一二硝基苯肼溶液：称取2，4一二硝基苯肼0.099g，用10mo/L HCl 50ml溶解后，加蒸馏水至500rnl，保存于棕色瓶中备用，此液可保存3个月。
0.4mol／L氢氧化钠溶液：32g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至2L。
lmol／L氢氧化钠溶液：10g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至250ml。
丙酮酸标准液(2 µmol／m1)：精确称取纯丙酮酸钠0.022g 于100ml容量瓶中，加0.1mol／L磷酸盐缓冲液至刻度。此液应新鲜配制。
GOT底物液(DL一门冬氨酸200mmol／L，a一酮戊二酸2mmol／L)：称取a一酮戊二酸0.073g和DL一门冬氨酸6.65g置于一小烧杯中，加入lmol／L氢氧化钠51.25ml使溶解，并校正pH至7.4，然后将溶液移入250ml容量瓶内，用0.1mol／L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。
GPT底物液：(DL一丙氨酸200mmol／L，a一酮戊二酸2mmol／L)：称取a一酮戊二酸0.073g和DL--丙氨酸4.475g置于一小烧杯中，加入0.1mol／L磷酸盐缓冲液(pH7.4)约200ml煮沸溶解后，待冷，用lmol／L氢氧化钠调pH至7．4(约加1.25m1)，再加0.1mol／L磷酸盐缓冲液至25Oml混匀，加氯仿数滴防腐，贮于冰箱内。
粗酶液的提取：取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0．05mol／LTris—HC1缓冲液（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。

1 谷草转氨酶(GOT)的测定：
0.1ml粗酶液 ＋ GOT底物液0．5ml(对照仅加粗酶液0.1ml)，置37℃水浴，60min后取出，各管加0.5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0.5ml GOT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，蒸馏水调零点，读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度，得吸光度差值，查工作曲线即可查得丙酮酸体积(m1)。若查得的丙酮酸体积超过0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定，测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(m1)。
工作曲线绘制：取lOml试管5支，各管加0.1mol／L磷酸盐缓冲液0.1ml，分别加GOT底物液0.5、0.45、0.4O、0.35、0.30ml，丙酮酸标准液0(对照管)、0.05、0.10、0.15、0.20ml。置37℃ 水浴5min，各管加0．5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0．5ml GOT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度，以各管丙酮酸体积为横座标，以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。

2 谷丙转氨酶(GPT)的测定：
0.1ml粗酶液 ＋ GPT底物液0．5ml(对照仅加粗酶液0.1ml)，置37℃水浴，30min后取出，各管加0.5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0.5ml GPT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，蒸馏水调零点，读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度，得吸光度差值，查工作曲线即可查得丙酮酸体积(m1)。若查得的丙酮酸体积超过0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定，测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(m1)。
工作曲线绘制：取lOml试管6支，各管加0.1mol／L磷酸盐缓冲液0.1ml，分别加GPT底物液0.5、0.45、0.4O、0.35、0.30、0.25 ml，丙酮酸标准液0(对照管)、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 ml。置37℃ 水浴5min，各管加0．5ml 2，4二硝基苯肼液终止反应，此时对照管补加0．5ml GOT底物液。再将各管置37℃水浴中20min，取出后各管加5.Oml 0.4mol／L NaOH，混匀，lOmin后用分光光度计比色，波长500nm，读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度，以各管丙酮酸体积为横座标，以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。
结果计算
转氨酶活度以每克植物鲜样在30min内反应生成的丙酮酸微摩尔(µmol)表示。
GOT活度，µmol／g·30min=(C×V×20)／(m×2)
GPT活度，µmol／g·30min=(C×V×20)／(m×2)
式中，C一丙酮酸标准溶液的浓度(µmol／m1)；V一由工作曲线查得的丙酮酸体积(m1)；2O一稀释倍数；2一反应时间换算系数，GOT实际反应时间为1h，按习惯本法酶活性以30min计算，故应除以2；m一植物鲜重(g)。

3 谷酰胺合成酶（GS）的测定：
方法1：
O.25mol／L 咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)：
O.30mol／L 谷氨酸钠溶液(pH7.O)：
30mmol／L ATP—Na溶液(pH7.O)：
O.5mol／L MgS04溶液：
羟胺试剂：
FeCl3溶液：
测定酶活性反应液组成如下：0.6ml咪唑-盐酸缓冲液(O．25mol／L，pH7.0),0.4ml谷氨酸钠溶液(O.30mol／L，pH7.O)，0.4ml ATP—Na溶液(30mmol／L，pH7.O)，0.2ml MgS04溶液(O.5mol／L)，酶粗液1.2ml。反应液在25℃水浴中保温5 min后，加入0.2 ml羟胺试剂开始反应，15 min后立即加入0.8 ml酸性FeCl3试剂终止反应。混合液在4000 r／min离心15 min，测定上清液在540nm处的光密度。一个GS活性单位定义为该反应条件下，在15min反应时间内催化形成1µmol r-谷氨酰异羟肟酸需要的酶量，总活性为：每克鲜样酶粗液在15min的反应时间内催化形成r-谷氨酰异羟肟酸的µmol数。（参考王小纯，熊淑萍，马新明，张娟娟，王志强的《不同形态氮素对专用型小麦花后氮代谢关键酶活性及籽粒蛋白质含量的影响》）
方法2：
酶活性反应液组成为：0.6 ml咪唑-盐酸缓冲液，0.4 ml谷氨酸钠溶液，0.4 ml ATP-Na溶液(30 mmol/L，pH 7．0)，MgSO4溶液(0.5 mol/L )，酶提取液1.2 ml。反应液0.2 ml在25℃水浴中保温 5 min，加入0.2 ml羟胺试剂开始反应。在25℃水浴中反应15min，加入0.8 ml反应终止液。混合液在4000×g离心15 min，在540 nm处测定上清液的光密度。一个GS活性单位定义为在该反应条件下，15 min反应时间内每克鲜重光密度的数值。（参考马新明，李琳，赵鹏，熊淑萍，郭飞的《土壤水分对强筋小麦‘豫麦34’氮素同化酶活性和籽粒品质的影响》）
方法3：（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）

方法4：依次取lml 咪唑-盐酸缓冲液、0．5mol／L MgCl·6H20、50mmol／L EDTA—Na 、lmol／L Glu—Na 、0．498mmol／L盐酸羟胺各0．2mL放入试管中，在迅速加入lmL粗酶液混匀，于30cC水浴上反应15min，然后立即取出，加入lmL终止显色液(0.37mol／L FeC1 、0.67mol／L三氯乙酸、0.2moL／L HC1)终止反应，在5000r／min下离心10min，取上清液测540nm处消光值，对照在加完所有反应液后，先加入lmL终止显色液，再加入lmL粗酶液，对照管的其余步骤与测试管相同。对照标准曲线求出r-谷氨酰胺基羟肟酸的生成量，计算酶的活性。（参考赵越，魏自民，马凤鸣的《不同水平铵态氮对甜菜硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活力的影响》）

4 谷氨酸合酶（GOGAT）的测定：
反应混合液包括0.4ml 20mmol／L的 L-谷氨酰胺，0.5ml 20mmol／L的a一酮戊二酸，0.1ml 10mmol／L的KCl，0.2ml 3mmol／L NADH和0.3ml酶液，总体积3.0ml，不足部分用25mmol／L的Tris-HCI缓冲液(pH7.6)补足(1．5m1)。反应启动后，用752紫外可见分光光度计于340nm处每30s测定1个消光值，连续测定11次，取光密度稳定减小的一段来衡量酶活性。一个GOGAT活性单位定义为在该反应条件下，每分钟反应混合液减少1µmolNADH为一个酶活性单位。（参考王小纯，熊淑萍，马新明，张娟娟，王志强的《不同形态氮素对专用型小麦花后氮代谢关键酶活性及籽粒蛋白质含量的影响》）

5 谷氨酸脱氢酶(GDH) 的测定：
提取液：0.2 mmol／L pH 8.2 Tris-HCl缓冲液。
反应液A：1.6µmol／L NAD + 360µmol／L Tris-HC1缓冲液。
反应液B：60µmol／L L一谷氨酸 + 1.6µmol／I NAD + 360µmol／L Tris-HC1缓冲液。
1 mL酶提取液+2 mL反应液B，以加反应液A为对照于340 nm处比色，每隔30s记录一次0D值，直至读数稳定。（参考张智猛，张威，胡文广，矫岩林，王磊，李伟芳的《高产花生氮素代谢相关酶活性变化的研究》）