食物过敏原蛋白的定量检测方法—科标检测.doc

食物过敏原蛋白的定量检测方法
现在食物过敏现象越来越引起人们的重视，在西方发达国家，1%～2% 的成人与5%～8% 的儿童都存在食物过敏现象，其中儿童主要以牛奶和鸡蛋过敏为主，而成人主要以海鲜贝壳类食物过敏为主。有明显迹象表明，食物过敏现象在近几年有严重的趋势。在世界卫生组织报告的威胁人类健康的因素中，食物过敏排在第 4位，并且现在仍然没有彻底有效的治疗食物过敏的方法。在食品加工工业中，原料里几乎不可避免的含有各种致敏蛋白，例如鸡蛋、牛奶、花生等，食物过敏患者想完全避免接触致敏物非常困难。
为确保食品标签的准确性和消费者的安全，可靠、定量的过敏原蛋白检测方法是非常必要的。因为食物过敏原在食品中的含量较少并可能包裹于食品基质中，所以食物过敏原的检测十分困难。极少量的过敏原蛋白即可引起严重的过敏反应，这对食物过敏原蛋白定量检测的灵敏度和准确性提出了更高的要求。
青岛科标检测研究院——生物实验室，拥有丰富的食品过敏原检测经验，可检测原材料食品和加工食品中的过敏源蛋白质，为食品生产商减少安全风险，保障食品安全、维护消
费者健康。
本文分别对基于单个蛋白(如ELISA法)和定量蛋白质组学的食物过敏原定量检测方法进行综述，单个蛋白检测技术的发展已经较为成熟，但尚不足以满足实际需要，而蛋白质组学方法的运用，为实现对多种食品过敏原同时进行高通量、高灵敏度的快速检测提供了新的手段。

1、基于单个蛋白的食物过敏原定量检测
基于单个蛋白的食物过敏原定量检测方法主要为免疫学方法，除传统免疫学方法外，生物传感器也被应用于检测当中。目前主要的过敏原定量检测方法主要包括如下几类：

1.1 酶联免疫吸附实验(ELISA法)
随着全自动酶标分析仪的普及，ELISA法在上世纪90 年代末期发展迅速，其特异性和灵敏度也有了很大的提高，大大扩展了其在食品检测领域中的应用。ELISA法是一种免疫测定技术，基础是抗原或抗体的固相化及酶标记。在最常用的双抗体夹心ELISA法中，首先将抗体结合在固相载体表面，使其与样品蛋白反应，然后加入酶标记的二抗来检测已结合于固相载体表面的样品蛋白。结合于固相载体表面的样品蛋白越多，酶标记二抗的显色反应就越强，由此进行样品蛋白的定量分析。
目前，在食物过敏原的各种检测方法中，ELISA法是使用范围最广的检测方法，多采用双抗体夹心法，具有特异性高、敏感性强、快速方便、设备投资小等优点，可以实现比较精确的定量检测。根据报道，使用双抗体夹心ELISA法检测牛奶过敏原蛋白的最低检出限可达 25μg/L。此外，还有用此法对大豆和花生过敏原蛋白进行检测的相关报道，也能达到相当的检测水平。正因为 ELISA 法的诸多优点，已经实施过敏原法规标准的欧盟、美国、加拿大和日本等国家均推荐ELISA 法为过敏原检测方法，而且现在商业食物过敏原检测试剂盒绝大多数也都是基于ELISA技术，在西方发达国家其应用已经比较普及。
为了进一步提高ELISA法的灵敏度与准确度，近年新兴了一种将ELISA与电感耦合等离子质谱(ICP-MS)相结合的方法，即ELISA-ICP-MS 法，在此方法中，用稳定同位素取代酶对二抗进行标记，然后可通过质谱进行定量分析。根据报道，用此法可以在 1g 的谷类食品混合物中检测出2μg 的花生过敏原。

1.2 RAST/EAST及RAST/EAST抑制实验
自从IgE 成功纯化及抗IgE 抗体成功制备后，放射过敏原吸附实验(RAST)与酶标记过敏原吸附实验(EAST)检测技术就建立起来，其基本原理都是在固相载体上使特异性IgE 抗体与食物过敏原结合，然后进行检测，现在已是一种标准化的食物过敏原检测方法，使用广泛。
在此基础上又建立了放射过敏原吸附抑制实验(RAST抑制实验)和酶标记过敏原吸附抑制实验(EAST抑制实验)，可对食物过敏原进行定量测定，其在食物过敏原检测中获得了广泛的应用。RAST/EAST 抑制实验的优点是可以实现全自动操作，避免了人为操作带来的误差；缺点是对人血清的依赖，人血清的个体差异性限制了这两种方法在食物过敏原定量检测中的应用。

1.3 火箭电泳(RIE)法
RIE 法是将含有已知抗体的琼脂制成琼脂板，冷凝后，在液板上的阴极端挖一排小孔，孔中分别加入一定量的待检样品及不同稀释度的标准抗原，进行电泳。抗原向阳极移动，并与抗体结合。在抗原、抗体比例适当的部位形成锥形沉淀峰，其形状如火箭，该峰的高度与抗原量成正比，可快速测出标本中过敏原的含量。
据报道用此方法检测了不同食品中鸡蛋、牛奶和花生蛋白的含量。RIE 的优点是检测速度快，缺点是制胶操作和染色过程比较繁琐。

1.4 组胺释放实验
致敏靶细胞被食品过敏原蛋白激发后会释放出组胺，然后用放射免疫法、荧光测定法检测组胺含量，再与合适参照进行比较，就可以对食品过敏原蛋白进行测定。其中阳性参照与阴性参照一般分别为抗IgE 抗体与样品介质，这样可以排除在实验中非特异性组胺释放造成的影响。
现已有通过体外组胺释放实验对大豆、牛奶和鸡蛋过敏原蛋白经行检测的报道，都表现出了很高的灵敏度与很好的重现性。

1.5 生物传感器
生物传感器是一项还未普及应用到食品分析中的技术。生物传感器可以即时测定特定分子之间的反应，把一个目标分子(可能是抗体或DNA片段)固定到传感器的表面，然后定量测定一个或两个分子间的键合作用。特点是分析时间短、自动化程度高。生物探测器技术可以用来测定特定的蛋白质或过敏原，也可以用于测定特定的DNA 片段。用微芯片技术检测食物过敏原，与其他检测方法相比，该法重现性和灵敏性较好，检测时间也短，在1h 内就可以完成检测。

以上是食物过敏原定量分析的一些经典方法，通过表 1 可以对各方法有更加直观的了解。

对比这些检测食物过敏原蛋白的方法可以发现，虽然检测方法各不相同，但共同点都是对单个蛋白进行的间接检测。以免疫学为基础的检测方法其相似点是运用血清进行抗原- 抗体的特异性反应，但是由于血清个体的差异性以及过敏原致敏表位被包埋等因素的影响，以免疫学为基础的检测方法就不可避免依赖于抗体/血清的制备和分离纯化。不同批次的抗体/ 血清对食物过敏原蛋白定量检测具有主要的影响。
近年来发展迅速的定量蛋白质组学为食物过敏原的定量分析提供了一条新的途径，无需抗体/ 血清可直接测定过敏原蛋白的含量。

2、基于定量蛋白质组学的食物过敏原定量检测
定量蛋白质组学是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系内所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门学科。而食品过敏原就是食品所含蛋白质混合体系中能引起人们过敏反应的一类蛋白质，所以，现在定量蛋白质组学与质谱技术应用于食品过敏原检测已有报道。
因为不同种类的蛋白质具有不相同的离子化能力，所以质谱在传统的蛋白质组研究中一般只用于对未知蛋白质的鉴定，不能实现蛋白质的定量分析，目前稳定同位素代谢标记方法和同位素亲和标签技术解决了这个问题。下面详细介绍这些技术。

2.1 蛋白质水平的定量分析
被分析物是蛋白质本身，在定量分析过程中蛋白质并没有修饰。将蛋白质混合物直接经过质谱分析仪，得到质谱分析图，不同于人类血清质谱图，食物混合物的质谱图并没有那么复杂，因此可以使用外标法对不同的蛋白进行定量分析。
以牛奶为例，牛奶中 20% 是乳清蛋白，其中包含α- 乳白蛋白、β- 乳球蛋白(A 和B)、牛血清白蛋白和免疫球蛋白等，Huber 等第一次运用质谱技术对牛乳清蛋白进行了定量分析，在浓缩液中测得α- 乳白蛋白、β-乳球蛋白B和β-乳球蛋白A的质量浓度分别为0.684、1.839mg/mL和1.599mg/mL。Monaci等在某牛奶果汁的样品中对以上这3 种牛奶过敏原进行了定量测定，最后所得检测限为4μg/mL。

2.2 肽段水平的定量分析
此方法的基础在于肽段丰度可以用质谱峰的信号强度来表现，它可以分为两大类：第一类为标记定量技术；第二类则为无标记定量技术。而前者则可细分为同位素标记目标肽段的质谱分析方法和同位素标记合成肽段作为内标物的质谱分析方法。由于此方法的检测物是肽段，所以在检测前必须对检测食物进行处理以获得可检测肽段。

2.2.1 同位素标记目标肽段的质谱分析方法
使用同位素标记目标肽段的质谱分析方法在近十年来取得了很大的发展，其基本原理是分别用轻型和重型同位素标记必需氨基酸，然后将不同标记的蛋白按一定比例混合并处理，分离纯化后进行质谱分析。通过对氨基酸序列相同但由不同同位素标记的肽段丰度的比
较，就可以得到各种蛋白的定量关系，所以此方法主要应用于相对定量分析，但其中很多方法同样也可以应用于绝对定量分析。
根据引入标记同位素方法的不同主要可以分为同位素代谢标记法(SILAC)、同位素亲和标签法(ICAT)、酶催化18O 同位素标记法和同重同位素标签标记定量法(iTRAQ)等。
使用同位素标记酪蛋白肽段，通过质谱分析，在饼干中可定量检测出 1.25μg/g 的酪蛋白；使用相似的方法在某香草冰淇淋中可定量检测出10μg/g 的主要花生过敏原蛋白Ara h 1。
2.2.2 同位素标记合成肽段作为内标物的质谱分析方法
同位素标记的合成肽段作为内标的绝对定量蛋白质组学基本原理是：在需检测蛋白质的氨基酸序列中选择一段合适的肽段作为模板，用化学合成或基因表达的方法合成带有一定同位素标记的相同肽段作为内标，此合成肽段与模板肽段仅相对分子质量有差异，然后通过检测肽段的质谱信号强度之比来对相应蛋白质进行定量分析。
使用合成肽段做内标物的方法对某巧克力果仁进行了花生过敏源Ara h 2与Ara h 3/4的分析，其中Ara h 2的检测限达到了5μg/g混合物，Ara h 3/4的检测限更是达到了 1μg/g 混合物。

2.2.3 无标记蛋白质组学定量分析方法
无标记蛋白质组学定量分析方法是近几年兴起的一种新技术，只需分析通过质谱大规模鉴定蛋白时所产生的数据即可实现定量分析。现有的无标记定量技术主要有两种：基于一级质谱信息和基于二级质谱信息。前者的依据是与一级质谱相关的肽段峰强度、峰面积、液
相色谱保留时间等信息，后者的依据是与二级质谱相关的每个蛋白质鉴定到的肽段总次数、所鉴定肽段的离子价位等信息。
无标记定量技术不需要同位素标签做内标，具有经济、高通量和省时省力等优点，但它也比较依赖于仪器的状态和样品的复杂性等因素，所以现阶段无标记定量技术的应用还不广泛，暂未见在食物过敏原定量检测方面的报道。

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