酿酒酵母的发酵过程优化.doc

酿酒酵母的发酵过程优化
戴璐
(常熟理工学院 生物与食品工程学院, 常熟 215500)
摘要: 该文以酿酒酵母为的生产菌，通过发酵过程的优化，重点考察了pH、溶解氧，测定残糖量和生物量的影响，并比较了分批培养、补料分批培养对酿酒酵母生长代谢的影响。发现补料分批培养比分批培养有利于酿酒酵母的生长与繁殖，有较多的细胞生物量的积累。
关键词: 酿酒酵母；发酵过程

Wine yeast fermentation process optimization
Dailu
(Changshu Institute of Technology, Biotechnology and Food Engineering Institute, Changshu 215500)
Abstract: The fermentation process of Saccharomyces cerevisiae is optimized. The effect of some ferment conditions，including pH, fermentation of oxygen, determination of residual sugar and biomass are researched.And this experiment is the partial training, filling materials for partial training s.cerevisiae growth metabolic effects. The results showed that the partial training for material of s.cerevisiae training to of the growth and reproduction, more cells biomass accumulation.
Key words: Saccharomyces cerevisiae; Ferment Process

酿酒酵母菌属于真菌界、子囊菌门、不完全子囊菌纲、酵母菌目、酵母菌科、酵母菌属( Saccharomyces)。酵母菌属含有若干种, 如酿酒酵母菌( S. cerex isiae)和波兰地酵母菌( S. boullard ii, 新种未正式命名) [1]。
酵母菌是重要的工业微生物与科学研究的模式生物，在食品、医药、能源化工和环境治理等领域有重要应用价值。野生酵母资源的开发利用是发酵工业菌种改良的基石，也是基因多样性的重要来源。其中葡萄酒酵母在葡萄酒酿造过程中起着至关重要的作用，将葡萄汁中的绝大部分糖转化为酒精和二氧化碳，同时生成甘油、高级醇、醛、酯等代谢产物，直接影响葡萄酒的色泽、香气及口感，决定着葡萄酒的质量，对葡萄酒特色的形成至关重要。酿酒酵母菌的发酵特性因菌株的不同而存在明显差异，菌株的不同导致利用的底物不同、生成的化学物质不同，从而使发酵产物的风味物质存在差异，赋予产品独特的风味[2]。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验菌株
酿酒酵母
1.1.2 培养基
PDA（斜面、平板培养基）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水1000ml，自然pH。制法：马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂（煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可），用4层纱布过滤，再加糖和琼脂，加热溶化后在补足水分至1000 ml，121℃灭菌20min。
种子培养基（YEPD培养基）：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0，121℃湿热灭菌20min。
发酵培养基：YEPD培养基。
1.1.3 器皿
电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，试管，玻璃棒，培养皿，移液管等。
1.2 酿酒酵母发酵工艺
1.2.1 分批发酵
将培养好的种子液以10%（v/v）接种量接种到发酵罐培养基中，180r/min，30℃培养14h，调节通气量为3L/min。从发酵开始，每隔2h在线读取发酵罐中发酵液pH，及溶解氧量。
1.2.2补料分批发酵
将培养好的种子液以10%（v/v）接种量接种到发酵罐培养基中，180r/min，30℃培养14h，调节通气量为3L/min。在细胞生长的对数生长期中后期一次性添加20g葡萄糖到发酵罐中。每隔2h在线读取发酵罐中发酵液pH，及溶解氧量。
1.3酿酒酵母发酵液残糖量测定
1.3.1葡萄糖标准曲线的测定：DNS法
3,5-二硝基水杨酸试剂：
甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml10%氢氧化钠溶液中，并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
乙液：称取255g酒石酸钾钠加到300ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5二硝基水杨酸溶液。
将甲乙二溶液混合既得黄色试剂，储于棕色瓶中备用。在室温放置7-10天以后使用。
葡萄糖标准溶液的配制：
准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。浓度为1mg/ml。
取9支25mm×250mm的试管，分别按下表加入试剂：
将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，摇匀。于520nm波长处测A值。以葡萄糖mg数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.2 残糖量测定
发酵过程中每隔2 h取出10ml发酵液测定残糖量。取样时间分别为0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h。
1.4 酿酒酵母发酵液生物量的测定
1.4.1 生物量测定（重量法）
发酵过程中每隔2 h取出10ml发酵液，3000r/min离心10min,弃上清液，湿菌泥在80℃下干燥24 h后称量，测定生物量。取样时间分别为0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h。

2结果与分析
发酵中残糖量、pH、生物量随时间的变化
2.1 分批发酵培养
2.1.1 标准曲线

图1 分批发酵时葡萄糖标准曲线
2.1.2发酵液的残糖量、pH、生物量随时间的变化
表1 分批发酵发酵液的残糖量、pH、生物量随时间的变化
时间 h 0 2 4 6 8 10 12 14
残糖量% 43.039 36.082 30.724 10.112 7.88 -0.603 -0.528 0.104
pH 5.8 5.52 5.26 4.93 4.8 5.03 5.13 5.13
生物量g/l 0 1.33 1.25 1.5 1.5 3 3.25 3.75

图2 分批发酵过程中发酵液pH、残糖量、生物量随时间的变化曲线
2.1.3生长代谢特征分析：
1> pH
在0-8小时内，由于酿酒酵母利用碳源即葡萄糖生成有机酸等中间代谢产物，pH一直下降；在8-14小时内，由于碳源减少，酵母利用氮源产生氨，发酵液pH又上升，故pH是随着培养时间、碳源量的变化而变化的。
2>残糖量
一直呈现下降趋势，但是在酿酒酵母的生长对数期残糖量下降迅速，这是因为生长对数期，微生物繁殖速度快，碳源被大量消耗；在酿酒酵母的生长衰亡期，残糖量基本不变，这是因为碳源基本被消耗殆尽，无剩余碳源可被转化为葡萄糖，进而被微生物利用。
3>生物量
在整个发酵过程中一直处于上升趋势。在酿酒酵母的生长平衡期和生长衰亡期，生物量上升速度快，这是由于在这两个时期微生物大量累积代谢产物，导致生物量的上升。
2.2 补料分批发酵培养
2.2.1 标准曲线
图3 补料分批发酵时葡萄糖标准曲线

2.2.2发酵液的残糖量残糖量、pH、生物量随时间的变化
表2 补料分批发酵发酵液的残糖量、pH、生物量随时间的变化数据
时间 h 0 2 4 6 8 10 12 14
残糖量% 59.124 59.995 40.580 16.464 13.852 4.101 3.665 4.710
pH 6.3 5.27 5.07 4.81 4.38 4.26 4.4 4.45
生物量g/l 3 3 1.1 2.2 4.2 3.3 4.5 4
图4 分批发酵过程中发酵液pH、残糖量、生物量随时间的变化曲线

2.2.3生长代谢特征分析
1>pH
在0-10小时内，由于酿酒酵母利用碳源即葡萄糖生成有机酸等中间代谢产物，pH一直下降，但是在分批发酵中8小时以后pH开始上升，在补料分批发酵过程中，由于又添加了葡萄糖，酵母继续产生有机酸，pH继续下降，直到10小时以后碳源消耗殆尽，酵母利用氮源产生氨，发酵液pH又上升。
2>残糖量
一直呈现下降趋势，但是在酿酒酵母的衰亡期残糖量下降迅速，生长对数期下降缓慢，是由于一部分细胞死亡减少了其它细胞的竞争导致的。
3>生物量
在生长初期保持不变可能是由于细胞个体发育适应环境的一个过程。之后的下降可能是由于有些细胞生长迅速消耗营养物质多导致种龄大的细胞竞争力弱而死亡。但是生物量总体还是上升的，这是由于微生物大量累积代谢产物的原因。
3结论
通过比较酿酒酵母在分批培养、补料分批培养两种发酵方式下发酵液中的pH、溶解氧及残糖量和生物量，得出的结论为补料分批培养是培养酵母细胞较为优化的方式。
由分批培养看出在发酵了6h时葡萄糖含量最低，在此时向发酵液中加入一定量的葡萄糖，可以延缓发酵液中残糖量的减少速度，缩短细胞的衰退期，产生更多的酵母细胞。
分批补料式培养能够调节培养环境中营养物质的浓度，延长微生物生长期的时间使其快速生长，可以节约上产时间。
文献结果表明，当温度在30℃时，酵母的生长代谢量都达到最大，此时酵母体内酶活力达到最大或者由于设置温度梯度大，未准确测出其最适温度。在较高温度下，酵母细胞发生自溶[3]，菌数减少，代谢相应降低。在测定pH对酵母生长代谢影响中发现，最适pH值为5时酵母的菌数最多，此时酵母对营养物质的吸收状况最佳，体内酶活力达到最大[4]。pH值为6时，酵母产生的酒精量最多，可能此时酵母生长速率慢，利于酵母发酵。从培养基生长曲线看，麦汁培养基浓度为1l°BX时，酵母生长代谢最快，11 °BX的麦汁提供了足够的碳源、氮源等营养物。当为12°BX的培养基时，可能过多的养分促进酵母的絮凝，因而生长代谢减慢。钙离子在对酵母生长影响时，可能维持细胞内外电荷处于稳态，或以其作为信号传递的信号物质，从而有利于细胞生长代谢[5]。酵母最适生长钙离子浓度为0.14 g·L-1，最适代谢钙离子浓度为0.07 g·L-1，可能生长时细胞耐受力强于代谢期。从酒精对酵母生长代谢的影响来看，最适生长酒精浓度为1％，而最适代谢酒精浓度为0％。因为生长时培养基中有一定的酒精存在可以抑制细胞进行产生代谢[6]。在没有酒精存在时，无反馈抑制作用，所以代谢产物产生多。酵母最佳生长条件是：温度30℃，pH值为5，麦汁培养基浓度为1I°BX，钙离子浓度为0.14 g·L-1，酒精浓度为1％；而酵母最适代谢条件略有不同，pH值为6，钙离子浓度为0．07 g·L-1，酒精浓度为0％。高于或低于上述条件，酵母生长代谢就会受到抑制[7]。所以可以根据这些条件来进行进一步优化。

4参考文献
[1] 夏晓华, 朱建国. 酿酒酵母菌的生物学特性[J]. 浙江检验医学, 2007,5(3)27.
[2] 李华. 现代葡萄酒工艺学[M]. 西安: 陕西人民出版社, 2000.
[3] 赵春海, 赵士豪. 钙镬对酿酒酵母发酵的影响[J]. 食品研究与开发. 2007,(10):46-48.
[4] 郑翔鹏. 氯化钙对啤酒酿造的影响[J]. 啤酒科技, 2005,(1):35-37.
[5] 董永胜, 杨亲正, 贾士儒. 压力对啤酒酵母生长及某些发酵性能的影响[J]. 酸酒科技. 2007,(1I):38-40.
[6] 王秋菊, 许丽, 潘军. 酵母菌生长曲线的测定及不同生长时问麦芽汁糖度的变化[J].兽药与饲料添加剂. 2006,(1):1-2
[7] 冯玉娟. 酿酒酵母生长代谢影响因素的测定[J]. 潍坊学院学报, 2010,10(6): 110-112.