海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1 的克隆.doc

编号NO.：

河北农业大学本科毕业论文

论文题目 海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1 的克隆

与生物信息学分析

学生姓名 刘通 学号2009014010216 成绩 86.3
学院 农学院 专业班级 农学0902
指导教师姓名 张艳 指导教师职称 讲师

材料目录：
1、任务书 （ 1 ）份
2、开题报告 （含文献综述） （ 1 ）份
3、指导教师评阅书 （ 1 ）份
4、答辩记录表 （ 1 ）份
5、论文正文 （ 1 ）份
6、其它材料

河北农业大学
本科毕业论文任务书

学 院： 农学院
教师姓名： 张艳
职 称： 讲师

2012年5 月4 日

专业名称
农学
论文
题目
海岛棉抗黄萎病基因GbEDS1 的克隆与生物信息学分析
题目
来源
国家自然科学基金
目的意义：
我国目前推广的棉花品种抗黄萎病性能差，不能满足市场的需要。因此，培育抗黄萎病棉花品种，是当前棉花育种迫切需要解决的问题。近年来，植物发育生物学研究取得了突飞猛进的发展，许多重要的发育机制在分子水平上得以阐明，这就为利用遗传工程的方法改造植物生长发育过程奠定了基础。抗黄萎病基因的研究能为品种改良提供依据具有显著的学术理论价值和潜在经济价值。
本研究利用RT-PCR和RACE技术从海岛棉克隆抗黄萎病相关基因EDS1的cDNA及开放阅读框序列（Open reading frame，ORF），并通过生物信息学分析，以预测该基因在棉花抗黄萎病过程中所起的作用，为基因功能验证提供理论依据。
可行性分析：
1、研究条件
课题组已有利用电子克隆方法、RT-PCR和RACE技术，从棉花中克隆出抗黄萎病相关基因的先例，并对基因进行了表达特异性分析、原核表达分析。同时课题组成员熟练掌握分子生物学理论基础和实验技术、生物信息学的应用因此，具备开展基因克隆技术和条件。
本实验室为河北省重点学科――作物遗传育种实验室和河北省作物种质资源重点实验室，具有先进的仪器设备条件，完全能够满足本研究的需要。因而在人员和仪器设备条件方面也是可行的。
2、预期结果
获得GbEDS1基因cDNA全长2190bp，开放阅读框长1848bp。
对该基因进行生物信息学分析预测其功能并为其功能的研究奠定理论依据。
3、可能存在的问题
从棉花样品中高效地提取完整的RNA，由于其植物体内多糖多酚含量高，给提取带来难度。

进度安排：
2013.3.1-2013.3.15: 查找国内外相关文献，学习与本试验有关的实验技术，制定实验方案。
2013.3.15-2013.325：提取棉花总RNA，获得质量较高的RNA，进行cDNA的片段合成。
2013.3.25-2013.4.25：设计并合成相关引物，扩增棉花相关基因GbEDS1及全长ORF，克隆并测序。
2013.4.25-2013.5.10：对基因进行生物信息学的分析，从而预测基因的功能。
2013.5.10-2013.5.30：整理实验材料，撰写论文，准备答辩。

专家意见：

专家签字：
年 月 日
学院意见:

院长：
年 月 日

农 学院 农学 专业
刘通 学生：
现把 2012-2013 学年，第 二 学期的毕业论文安排下达给你，你本学期承担的毕业论文任务如下：
1、依据本任务书中论文题目、目的意义、可行性分析的内容完成开题报告。
2、按照开题报告的要求按期完成毕业论文各项工作的实施。
3、完成毕业论文的撰写。
4、完成毕业论文的答辩。

请按相关要求完成毕业论文任务。

教师签字：
2012年5月4 日

河北农业大学
本科毕业论文开题报告

题 目： 海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克
隆与生物信息学分析

学 院： 农学院
学生姓名： 刘通
专 业： 农学
班级学号： 2009014010216
指导教师姓名： 张艳
指导教师职称： 讲师

2012 年 6 月5 日

学生姓名
刘通
专业班级

农学0902
学 号
2009014010216
指导教师
张艳
职 称
讲师
所在学院
农学院
论文名称
海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析
选题依据：
理论依据
本研究根据不同物种的EDS1核酸保守区域设计简并引物，利用RT-PCR和RACE技术从海岛棉克隆抗黄萎病相关基因EDS1的cDNA及开放阅读框序列（Open reading frame，ORF），并利用生物信息学软件分析序列特征特性。
目的意义
棉花是世界上重要的经济作物，据估计，棉花创造的年产值达1800-2000亿美元，全世界有18亿人口以种植棉花为生[1]棉花在整个生长过程中都受到病害的威胁，而黄萎病是棉花病害中对生产和产量威胁最大、危害最重的病害。棉花黄萎病（Verticillium wilt）是一种土传真菌性病害，由于其寄主广泛、土壤传播快、抗逆性强和变异性大等特点，已经成为棉花生产上第一大病害[2]。随着植物抗病机理研究的不断深入和基因工程手段的运用，通过向棉花中定向导入外源抗病基因以提高棉花对黄萎病的抗性，创造新的抗病种质已经成为防治黄萎病的有效途径[3, 4]。
EDS1（enhanced disease susceptibility 1）基因在1999年被首次克隆[5, 6]，研究表明，EDS1是烟草中RPS4调节的过敏反应HR所依赖的一个信号元件[7]；番茄中Ve1介导的对大丽轮枝菌的抗性反应依赖于EDS1和NDR1[8, 9]；葡萄EDS1基因具有抗白粉病的作用[10]。EDS1诱导了R基因控制的抗性，即调节了活性氧的爆发及HR反应的表达，并且通过在侵入位点积累水杨酸（Salicylic Acid, SA）的方式增强了对病原菌的抵抗作用[11, 12]。研究报道进一步证实EDS1基因是植物抗病反应中的一个重要信号元件。因此，关于EDS1的研究对于解决植物致病和抗病机制、进行品种改良和针对分子靶标进行新农药的开发备受广泛的关注。
关于植物抗病信号网络中参与抗病反应的关键基因，不同物种在抗病机制上可能具有一定的保守性（Fradin 等, 2009; Fradin等, 2011; 陈捷胤, 2010; Gayoso, 2010）。基于此，本研究将根据不同物种的EDS1核苷酸保守区域设计简并引物，通过RT-PCR和RACE技术克隆海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1并对其进行生物信息学分析。研究结果将为棉花抗黄萎病育种提供重要基因资源，为解析黄萎病抗性机制提供理论依据。
参考文献
[1] Kumria R, Sunnichan V G, Das D K, et al. High frequency somatic embryo production and maturation into normal plants in cotton (Gossypium hirsutum) through metabolic stress[J]. Plant Cell Rep, 2003, 21: 635-639.
[2] 周兆华, 张天真, 潘家驹, 等. 大丽轮枝菌在棉花品种上的致病力分化研究[J].中国农业科学，2000, 33 (2): 51-57．
[3] 简桂良, 卢美光. 棉花抗黄萎病品种选育方法探讨[J]. 植物病理学报, 2004, 34(4): 356-360.
[4] 潘家驹, 张天真. 黄萎病抗性遗传研究[J]. 南京农业大学学报, 1994, 17(3): 8-18.
[5] Falk A, Feys B J, Frost L N, Jones J D G, Daniels M J, and Parker J E. EDS1, an essential component of R gene-mediated disease resistance in Arabidopsis has homology to eukaryotic lipases [J]. Proc Natl Acad Sci USA 96, 1999, 3292-3297.
[6] Jirage D, Tootle T L, Reuber T L, Frost L N, Feys B J, Parker J E, Ausubel F M, and Glazebrook J. Arabidopsis thaliana PAD4 encodes a lipase-like gene that is important for salicylic acid signaling [J]. Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96:13583-13588.
[7] Goodman R N, Novacky A J. The hypersensitive reaction in plants to Pathogenes [M]. APS Press, 1994.
[8] Fradin E F, Zhang Z, Juarez Ayala J C, Castroverde C D, Nazar R N, Robb J, Liu C M, Thomma B P. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1[J]. Plant Physiol, 2009, 150: 320-332.
[9] Expression of RPS4 in tobacco induces an AvrRps4-independent HR that requires EDS1, SGT1 and HSP90 [J]. Plant Science, 2004, 10: 213-224.
[10] Fei Gao, Xiao Meishu, Mohammad, Babar Ali, Susanne Howard, Nan Li, Patrick Winterhagen, Wenping Qiu, Walter Gassmann. A functional ortholog is differentially regulated in powdery mildew resistant and susceptible grapevines and complements an Arabidopsis EDS1 mutant [J]. Planta, 2010, 231:1037-1047.
[11] Feys B J, Moisan L J, Newman M A, and Parker J E. Direct interaction between the Arabidopsis disease resistance signaling proteins, EDS1 and PAD4[J]. EMBO, 2002, 20:5400-5411.
[12] Rustérucci C, Aviv D H, Holt B F, Dangl J L, and Parker J E. The disease resistance signaling components EDS1 and PAD4 are essential regulators of the cell death pathway controlled by LSD1 in Arabidopsis [J]. Plant Cell, 2001, 13: 2211-2224.

文献综述：
棉花黄萎病是一种土传的维管束真菌病害，落叶型菌系致病危害性强、在土壤内难以根除，所以分离构建抗黄萎病基因和培育转基因抗黄萎病棉花就显得尤为迫切。Zhou等[1]利用PCR扩增得到了萝卜Rs - AF1基因，体外抑菌实验表明，Rs - AF1 对大丽轮枝菌的孢子萌发和菌丝生长有明显的抑制作用。窦道龙[2]利用35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因(从拟南芥中克隆的)的组成型表达载体对陆地棉品种进行花粉管通道法转化，抗黄萎病鉴定结果显示转基因植株对黄萎病的抗性都明显增强。另外，从海岛棉中克隆到了多聚半乳糖醛酸酶(PGIPs)基因，这是从棉属植物中克隆的第一个PGIP基因。PGIP基因编码的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白可以与真菌内源多聚半乳糖醛酸酶非抑制性结合，降低了该酶的活性，抑制真菌的作用，同时还诱导寡聚糖的合成，进一步诱导棉花的防御反应。最近，一些研究者从海岛棉品种中构建了用于抗黄萎病基因的克隆及其相关研究的文库[3, 4]。
目前，棉花抗黄萎病基因工程中应用的基因主要有几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、植物防卫素、硫素及葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GO)等外源抗病基因[5]。其中，比较成功的报道是GO基因，该基因编码的葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2，H2O2 在直接抑制病原菌生长的同时，也可作为信号转导物质诱导棉株系统抗性的形成。王志兴、张宝红等分别将GO基因导入棉花，获得对黄萎病抗性明显提高的棉花株系[6, 7]。蔡应繁、崔百明等利用遗传转化法将抗真菌的β-1，3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因导入棉花，经Southern 杂交检验，已得到阳性结果，进一步的研究还在进行中[8, 9]。乐锦华等用花粉管通道法将菜豆几丁质酶基因与烟草β-1，3-葡聚糖酶基因双价植物表达载体pBLGC导入新疆棉花主栽品种(系) 550、822、1304 和石远321，通过PCR、Southern blot检测，进行黄萎病抗性筛选，得到抗病性良好且遗传性稳定的转基因抗病棉花[10]。
20世纪70年代以来，随着植物基因工程技术的发展，应用遗传转化的方法能够打破物种之间的生殖隔离障碍，而且可以获得生物的定向变异、提高育种的目的性和可操作性，为创造新的生命类型开拓了无限广阔的前景。目前，植物抗病基因工程中常用的基因主要包括以下几类[1]：编码引起植物广谱抗性蛋白的基因，编码具有抑菌或抗菌活性蛋白的基因，与植物结构相关的防御基因，病原菌致病因子的解毒或中和基因，参与植保素代谢的基因，总之，表达这些基因的植物对真菌的抗性大都得到了不同程度的提高，其中，许多基因协同表达一般比单基因转化效果明显。所以，可以把这些基因用于棉花抗病基因工程育种，通过它们的过量表达来提高棉花中萜类物质的含量，把上面的基因单独或一同转入棉花中来介导并提高棉花对黄萎病的抗性。
参考文献
[1] Zhou, Xiang, Jun Lu, Shan, et al. A cotton cDNA (GaPR10) encoding a pathogenesis related protein with in vitroribonuclease activity Science, 2002, 162 (4): 629-637.
[2] 窦道龙. 棉花抗黄萎病基因工程研究和防卫反应相关基因的克隆, 中国农业科学院博士研究论文, 2002
[3] 左开井, 吴菲, 唐克轩等. 海岛棉品种根部黄萎病菌诱导表达全长cDNA文库. 棉花学报, 2002, 14 (5) : 291-294.
[4] Neumann M J, Dobinson K F. Sequence tag analysis of gene expression during pathogenic growth and microsclerotia development in the vascular wilt pathogen Verticillium dahliae Fungal Genetics & Biology, 2003, 38 (1) : 54-63.
[5] 段红英, 丁笑声. 棉花抗黄萎病基因工程研究综述, 作物杂志, Crops, 2007, 01
[6] 王志兴. 转基因抗病棉花和抗虫马铃薯株系的培育, 中国科学院植物研究所博士后研究工作报告, 2000.
[7] 张宝红, 姚长兵, 巩万奎等. 棉花葡萄糖氧化酶基因转化棉花和抗性愈伤组织的获得, 棉花学报, 2001, 13 (2): 78-81.
[8] 蔡应繁, 裴炎. 抗真菌基因导入棉花创造高抗黄萎病材料. 西南农业学报, 2000, 13 (4): 45-49.
[9] 崔百明, 祝建波, 肖路等. 转β-1, 3-葡聚糖酶和几丁质酶基因棉花. 生物技术, 2002, 12 (4): 1-2.
[10] 乐锦华, 祝建波, 崔百明等. 利用目的基因转化技术培育棉花抗病新品种. 石河子大学学报, 2002, 6 (3): 173-178.

研究方法、内容：
1研究方法
(1) 棉纤维发育相关基因GbEDS1的克隆。
2) 基因的生物信息学分析，主要包括以下内容：
a) 分析基因编码蛋白质的氨基酸序列分析；
b) 对基因信号肽及跨膜域的预测；
c) 蛋白质模体分析；
d) 亚细胞定位；
e) 序列同源性分析。
(3)基于生物信息学的分析，对所克隆的基因进行功能的预测。
2 研究内容
(1) GbEDS1基因的克隆。
a)棉花总RNA的提取与cDNA的合成；
b) GbEDS1基因的克隆和序列分析。
(2) GbEDS1基因的蛋白分析。
a) GbEDS1基因的氨基酸序列分析；
b) GbEDS1的亲疏水性分析；
c) GbEDS1的信号肽分析。
(3) GbEDS1序列与其他物种EDS1同源比对分析。

进度安排：
2013.3.1-2013.3.15: 查找国内外相关文献，学习与本试验有关的实验技术，制定实验方案。
2013.3.15-2013.3.25：提取棉花总RNA，获得质量较高的RNA，进行cDNA的片段合成。
2013.3.25-2013.4.25：设计并合成相关引物，扩增棉花相关基因GbEDS1及全长ORF，克隆并测序。
2013.4.25-2013.5.10：对基因进行生物信息学的分析，从而预测基因的功能。
2013.5.10-2013.5.30：整理实验材料，撰写论文，准备答辩。
指导教师意见：
论文选题针对性强，试验材料有代表性，试验方案可行，预期结果明确，同意开题。

指导教师：
2012年9月 30日

审 核 小 组 成 员
姓 名
职 称
备 注
姓 名
职 称
备 注
王省芬
教授

李文龙
讲师

刘立峰
教授

李志坤
副教授

李喜焕
副教授

开题报告记录：
棉花RNA提取过程如何防止其降解？
基因克隆过程中如何避免基因组的干扰？

审核小组评语：
论文选题依据比较充分，试验设计比较合理，研究方法可行，工作量较大，研究结果对于棉花黄萎病抗性的改良具有一定理论意义和应用前景。同意进入下一阶段的试验。

审核小组组长：（签字）
2012年 10 月 20 日
学院意见：

院长：
年 月 日

河北农业大学本科毕业论文指导教师评阅书
学生姓名：刘通　　　　　　　 　　　　　 学　　号：2009014010216
专业班级：农学0902　　　　　　　　　　　 所在学院：农学院
论文题目：海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析　　　　　　　　　　 　　　　
指导教师评语：
该同学遵守学校的各项规章制度，对工作认真负责，能够较好的完成各项实习任务。学习态度端正，具有较为扎实的生物科学基础理论和专业知识。
论文对棉花抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析进行了研究，论文选题针对性强，依据充分，具有一定的科学意义和应用价值。试验设计科学合理，研究方法可行，符合本科论文要求。论文写作格式规范，条理清晰，层次分明，数据可靠，结果分析透彻，文献参考得当，符合一般科技论文写作要求。该生在做毕业论文的研究过程中基本掌握了本学科领域的基础理论和专业知识。

论文不足之处在于：
（1）前言部分过于繁琐，可以删去与研究内容相关不大的部分；
（2）文章参考文献格式尚需进一步修改；

成 绩 评 定：
87.6
是否同意答辩：

指导教师（签名）：
年 月 日

河北农业大学
本科毕业论文答辩评分表
评分指标
分 值
评 价 内 容
得 分
论文选题
10
选题有重要理论意义或实用价值。立题依据充分。

文献引用
12
阅读、引用文献资料较广泛，较全面了解本领域学术动态，综合分析能力较强。

论文难度
及工作量
14
难度较大，工作量大。

论文成果
的创新性
12
有独到见解，有较大的创新性成果。

理论基础与科研能力
16
具有坚实的基础理论和系统的专门知识，具有较强的独立从事科研工作的能力，研究方法和技术体系得当。

写作能力
16
条理清楚，层次分明，说理透彻，文笔流畅，表格、绘图准确规范，中外文摘要简明扼要，语句通顺，语法正确，符合科技写作规范。

答辩报告
10
能简明扼要、重点突出地阐述论文或设计的主要内容，有新见解，结论明确；时间掌握恰当。

回答问题
10
思维敏捷，逻辑性强，准确流利地回答各种问题。

总 分
100

87.6
注：本表为答辩小组成员评分用表，评分标准参照《河北农业大学毕业论文质量评定参考标准》

河北农业大学
2013 届本科毕业论文答辩记录表
所在学院：农学院 专业班级： 农学0902 时间：2013 年 6 月 6日
学 生 姓 名
刘通
学 号
2009014010216
指导教师姓名
张艳
职 称
讲师
毕业论文题目：海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析
答 辩 小 组 成 员
姓 名
职 称
成 绩
姓 名
职 称
成 绩
王省芬
教授

李志坤
副教授

刘立峰
教授

李喜焕
副教授

李文龙
讲师

答辩小组评语：

答辩小组组长：（签字）
2013年 6 月 6 日
答 辩 成 绩：
87.6

河北农业大学
本科毕业论文(设计)

题 目：海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆
与生物信息学分析

学 院： 农 学 院
专业班级： 农学0902班
学 号： 2009014010216
学生姓名： 刘 通
指导教师姓名： 张 艳
指导教师职称： 讲 师

二O一三年 六 月 一 日

海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆
与生物信息学分析
农学专业 刘通
摘要：本研究根据不同物种的EDS1核酸保守区域设计简并引物，利用RT-PCR和RACE技术从海岛棉克隆抗黄萎病相关基因EDS1的cDNA及开放阅读框序列（Open reading frame, ORF）。GbEDS1 cDNA全长2190bp，其中5′非编码区168bp，3′非编码区174bp，ORF为1848bp，编码615个氨基酸。GbEDS1基因核酸序列与毛果杨EDS1(XM-002322106）具有64%的同源性，该基因内部无信号肽结构
关键词：棉花; 抗黄萎病; GbEDS1; 克隆; 生物信息学分析
Molecular Cloning and Bioinformatics Analysis of GbEDS1 Related with Verticillium Wilt Resistance from Gossypium barbadense
Author:Liu Tong
Major: Agronomy
Abstract: Degenerate primer was designed according to conserved domains of Enhanced Disease Susceptibility1 (EDS1) from different species. Opening reading frame and cDNA sequences of GbEDS1 related to Verticillium wilt resistance was isolated by RT-PCR and RACE technologies. The 2190bp cDNA sequence of GbEDS1 contained a 168bp 5′-UTR and a 174bp 3′-UTR，as well as an open reading frame of 1848bp encoding a 615 amino acids. The identity of the nucleotides between GbEDS1 and EDS1 of poplar (XM-002322106) was 64%. No signal peptide was in the amino acid sequence.
Keywords: Cotton; Verticillium wilt resisitance; GbEDS1; Clone; Bioinformatics Analysis
棉花是世界上重要的经济作物，据估计，棉花创造的年产值达1800-2000亿美元，全世界有18亿人口以种植棉花为生[1]。棉花在整个生长过程中都受到病害的威胁，而黄萎病是棉花病害中对生产和产量威胁最大、危害最重的病害。棉花黄萎病（Verticillium wilt）是一种土传真菌性病害，由于其寄主广泛、土壤传播快、抗逆性强和变异性大等特点，已经成为棉花生产上第一大病害[2]。随着植物抗病机理研究的不断深入和基因工程手段的运用，通过向棉花中定向导入外源抗病基因以提高棉花对黄萎病的抗性，创造新的抗病种质已经成为防治黄萎病的有效途径[3, 4]。
EDS1（enhanced disease susceptibility 1）基因在1999年被首次克隆[5, 6]，研究表明，EDS1是烟草中RPS4调节的过敏反应HR所依赖的一个信号元件[7]；番茄中Ve1介导的对大丽轮枝菌的抗性反应依赖于EDS1和NDR1[8, 9]；葡萄EDS1基因具有抗白粉病的作用[10]。EDS1诱导了R基因控制的抗性，即调节了活性氧的爆发及HR反应的表达，并且通过在侵入位点积累水杨酸（Salicylic Acid, SA）的方式增强了对病原菌的抵抗作用[11, 12]。研究报道进一步证实EDS1基因是植物抗病反应中的一个重要信号元件。因此，关于EDS1的研究对于解决植物致病和抗病机制、进行品种改良和针对分子靶标进行新农药的开发备受广泛的关注。
关于植物抗病信号网络中参与抗病反应的关键基因，不同物种在抗病机制上可能具有一定的保守性（Fradin 等, 2009; Fradin等, 2011; 陈捷胤, 2010; Gayoso, 2010）。基于此，本研究将根据不同物种的EDS1核苷酸保守区域设计简并引物，通过RT-PCR和RACE技术克隆海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1并对其进行生物信息学分析。研究结果将为棉花抗黄萎病育种提供重要基因资源，为解析黄萎病抗性机制提供理论依据。
1 材料方法
1.1供试材料
供试海岛棉抗病品种Pima90-53，强致病力菌系均由河北农业大学棉花遗传育种研究室提供。
大肠杆菌DH5α感受态细胞、克隆载体pMD19-T、RNA提取试剂、T4DNA连接酶、限制性内切酶、dNTP、TaqDNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶、LATaqDNA聚合酶、DNaseI、RNaseI均为TakaRa宝生物（大连）有限公司产品。
UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司，普通质粒小提试剂盒（离心柱形）购自天根生化科技（北京）有限公司。
SMARTTM RACE cDNA Synthesis Kit为Clontech公司产品，UNIQ-10柱式DNA凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。
1.2 试验方法
棉花幼苗采用无菌培养。选择均匀饱满无病虫害的脱绒后的种子，用0.1%的HgCl2浸泡8min，再用无菌水洗涤4-6次。然后在无菌水中浸泡36h，置于预先配好的MS培养基中，采用光照16h/黑暗8h，昼温28℃，夜温25℃培养。待棉花幼苗子叶完全展开时，选取长势一致的植株然后在无菌条件下将幼苗轻轻拔出并浸泡在黄萎病菌孢子悬浮液中（孢子浓度为15×107cfu/mL）30秒，并将处理后的幼苗重新移栽到MS培养基中生长。收集根、茎和叶组织材料用0.1%DEPC水冲洗干净，在液氮中充分研磨后置于-70℃冰箱冷冻保存备用。
1.3 棉幼苗总RNA的提取与cDNA的合成
棉幼苗高质量总RNA的提取采用北京奥莱博生物技术有限公司的植物RNA提取试剂盒，严格按照说明书步骤操作。RNA电泳所用电泳槽，胶板，胶槽，梳子均用0.1% DEPC水浸泡过夜，备用。配制1.0%琼脂糖凝胶，取1~2uLRNA，加入2uL用0.1% DEPC水配制的溴酚兰，点样，电泳。紫外灯下观察电泳结果。
使用TaKaRa公司的PrimerScriptTM反转录酶试剂盒说明书所述反转录RNA，获得第一链cDNA。
1.4 GbEDS1保守序列的分离
(1) 利用已经发表的其他物种上相关基因的序列，采用Blast程序在NCBI网站进行棉花EST数据库比对，寻找出高度同源的序列，将同源序列进行拼接组装成重叠群(contig)；
(2) 以重叠群为种子序列，再次Blast检索棉花的EST数据库和序列组装，延伸重叠序列，重复上述过程，直到没有新的EST检出即重叠群序列不再延伸，从而生成最终的最长的新生序列，作为种子序列的延伸产物；据种子序列的延伸产物，设计相关引物，并且到相应的棉花材料中检验延伸序列的真实性。
1.5 目的基因的3′RACE、5′RACE扩增
以反转录的3′RACE或5′RACE的cDNA为模板，使用试剂盒中的通用引物UPM和基因特异引物GSP进行扩增。
1.6目的基因的生物信息学分析
参考13文献的方法[13]进行各个基因的生物信息学分析，相关工具软件、网址和方法对GbEDS1序列进行序列分析。
2 结果与分析
2.1 棉花总RNA的提取
1.2%琼脂糖凝胶电泳检测棉花总RNA的完整性：电泳图谱呈现了典型的28S、18S RNA带型，且无明显的拖尾现象，比例约为2:1(图1），表明提取的RNA无明显降解，可进一步用于RT-PCR实验。

图1 棉花根部总RNA电泳图
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from G. barbadense L
2.2 GbEDS1基因编码区片段的克隆
以黄萎病菌诱导的Pima90-53根部总RNA为模板，通过RT-PCR，扩增出约1140bp大小的片段（图2），与预期大小一致。测序结果表明，克隆插入片段大小为1142bp，和拼接的预期片段大小一致。将阳性克隆的测序结果与NCBI数据库做BlastN比对，结果表明所获片段与杨树和葡萄EDS1同源性分别为64%和62.2%，初步推断此cDNA片段是棉花GbEDS1基因编码区的部分序列。

图2 GbEDS1基因cDNA种子序列PCR产物
Fig.2 PCR product of seed sequence of GbEDS1 cDNA
M:DL2000 Marker;1-2:PCR产物.
2.3 GbEDS1基因5′端和3′端序列的克隆
通过5′-RACE和3′-RACE反应分别获得了约1500bp的5′端片段和750bp的3′端片段（图3），通过pMD19-T载体克隆测序后，经序列拼接获得GbEDS1基因cDNA全长序列。

图3 5′-RACE和3′-RACE反应的PCR扩增
Fig. 3 PCR product amplified from 5′-RACE and 3′-RACE.
M1, M2:DL2000 Marker; 1-3:PCR产物.
2.4 GbEDS1开放读码框的克隆
基于全长cDNA序列设计引物，PCR扩增后获得了1840bp左右的目的片段（图4），经测序分析此全长序列与拼接序列完全相同。

图4 GbEDS1基因ORF PCR产物
Fig. 4 PCR product of the GbEDS1 ORF
M: DL2000 Marker; 1: PCR产物
2.5 GbEDS1的生物信息学分析
2.5.1 GbEDS1的氨基酸序列分析
将GbEDS1基因编码区的1848个核苷酸译成氨基酸序列后，用DNAstar的Protean分析：分子量为68.58 KD，理论等电点为7.938。共编码615个氨基酸。
2.5.2 GbEDS1的信号肽分析
使用SignalP-信号肽预测工具http://www.cb