黑木耳黑色素体外抗氧化性能力测定.doc

9-12月份，实验计划
9-11月中旬，黑木耳黑色素体外抗氧化性能力测定
11月下旬至1月，数据处理及论文写作
《黑木耳黑色素的体外抗氧化活性》 FC 3.146 LWT 2.114 农业工程学报
《真菌黑色素研究进展》微生物学通报

预实验：黑木耳黑色素体外抗氧化性能力测定
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验样品
黑木耳黑色素（自己提纯）（无标记 HPLC检测纯度>99%）
1.1.2主要试剂
1.1.3主要仪器
超微弱化学发光测量仪
可见分光光度计
1.2 样品溶液的准备
精密称取4.6mg melanin，70%乙醇定容至10mL，配成浓度为10-3mol/L的溶液。分别吸取0.1mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL依次定容至10mL，配成1×10-5mol/L、5×10-5mol/L、10×10-5mol/L、15×10-5mol/L、20×10-5mol/L和25×10-5mol/L的溶液。

1.3 试剂的配制
（1）0.2mol/L的PBS（pH6.6）
（2）0.3%的K3[Fe(CN)6]
（3）10%三氯乙酸
（4）0.05mol/L的鲁米诺：用0.05mol/L的NaOH溶液配制，在避光处保存，临用前用双蒸水稀释成1mmol/L的溶液。
（5）0.01mol/L的邻苯三酚：用1mmol/L的HCl溶液配制，4℃冰箱中保存，用前用双蒸水稀释成6.25×10-4mol/L的溶液。
（6）0.05mol/L的pH10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液：含0.1mmol/L的EDTA，用前现配。
（7）鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液a：将（6）与（4）按体积比2：1混合而成。
（8）1mmol/L的CuSO4溶液
（9）1mmol/L的邻菲啰啉溶液
（10）0.05mol/L的硼砂溶液
（11）1mmol/L的Vc溶液
（12）0.15%的H2O2溶液
（13）0.15mol/L H2O2
（14）鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液b:0.1mmol/L的鲁米诺与pH9.5的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液（V/V,1:17）配制而成。
1.4实验方法
1.4.1还原力的测定
取1mL的样品溶液+0.2mL的0.2mol/L的PBS（pH6.6）+1.5mL0.3%K3[Fe(CN)6]于试管中混匀，50℃水浴反应20min,流水速冷，加入1mL10%三氯乙酸混匀，以3000r/min离心10min，取2mL上清液，加0.5mL0.3%FeCl3混匀，再加3mL蒸馏水摇匀，以蒸馏水调零，测定A700，A700越大，表示还原能力越强。用蒸馏水作为无还原能力对照，Vc作为有还原能力对照。
1.4.2清除超氧阴离子能力的测定
采用邻苯三酚鲁米诺化学发光体系测定清除超氧阴离子能力：测定时，向发光池中注入10.0μL不同浓度的样品（以样品缓冲溶液为对照）然后注入6.25×10-4mol/L的邻苯三酚0.05mL，最后加入鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液0.94mL启动反应（30℃），间隔2s记数发光强度，测定300s内化学发光动力学曲线，至出现峰值，用蒸馏水做空白对照组，本底发光强度为未加邻苯三酚时的发光值。平行测定三次，取平均值，计算抑制率。
抑制率=[(Cl1-Cl2)－(Cl2-Cl0)]/ (Cl1-Cl0)×100%
式中Cl1为空白对照组的相对发光强度，Cl0为本底组相对发光强度，Cl2为样品组相对发光强度。
1.4.3清除羟基自由基能力的测定
采用邻菲啰啉化学发光体系（CuSO4-邻菲啰啉-Vc-H2O2）测定样品溶液对·OH的清除作用。加入不同浓度的样品溶液50μL在样品池中，分别依次加1mmol/L的CuSO4溶液50μL，1mmol/L的邻菲啰啉溶液50μL及0.05mol/L的硼砂溶液700μL（pH=9.0）充分混合，快速加入100μL1mmol/LVc和50μL0.15%H2O2溶液，立即启动化学发光系统，间隔3s计数，记录400s内化学发光动力学曲线，至出现峰值，用蒸馏水做空白对照组，本底发光强度为未加H2O2时的发光值。平行测定三次，取平均值，计算羟基自由基清除率（%）的方法同1.4.2。
1.4.4清除H2O2能力的测定
采用H2O2-鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液（pH=9.5）体系检测H2O2。取各浓度的待测样品50μL于样品池中，加入50μL0.15mol/L H2O2和900μL鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液b，反应总体积为1mL，启动发光系统，间隔2s记数，至出现峰值，记录180s内化学发光动力学曲线。平行测定三次，取平均值，计算H2O2清除率（%）的方法同1.4.2。
1.4.5抗脂质过氧化活性的测定
硫氰酸铵比色法。以其对亚油酸过氧化抑制率表示其抗脂质过氧化活性。准确称取0.2840 g亚油酸、0.2804 g吐温-20，再加入10 mL pH7.0的磷酸盐缓冲液（以0025 mol/L磷酸二氢钾和0.025mol/L的磷酸氢二钠配制）定容至50 mL，得到亚油酸乳液。准确称取0.5 mg待测样品，溶解于0.5 mL的蒸馏水中，再与2.5 mL亚油酸乳液混合均匀后，置于37℃恒温箱中保温45h，得培养液。取培养液0.1 mL，按顺序加入4.7 mL 75%乙醇、0.1 mL 30%硫氰酸铵、0.1 mL氯化亚铁（0.02 mol/L，用3.5%盐酸配制），混合均匀后，室温下静置3 min，在波长510 nm下测吸光值。每个样品重复3次，对照以亚油酸代替样品。按下式计算对亚油酸过氧化抑制率。
IlP=[1－（A1/A0）]× 100% （4）
式中IlP 对亚油酸过氧化的抑制率，%；A1 加入样品后的吸光度；A0 ——对照吸光度。
Mitsuda H, Yasumoto K, Iwami K. Antioxidative action of indole compounds during the autoxidation of linoleic acid[J]. Eiyo to Shokuryo，1966，19：210－214．

2 实验方案
2.1还原力的测定

实验编号
样品浓度
吸光度
吸光度平行
对照（Vc）

1
1×10-5mol/L

2
5×10-5mol/L

3

10×10-5mol/L

4
15×10-5mol/L

5
20×10-5mol/L

6
25×10-5mol/L

2.2 清除超氧阴离子能力的测定

实验编号
样品浓度
超氧阴离子清除率
超氧阴离子清除率平行
1
1×10-5mol/L

2
5×10-5mol/L

3
10×10-5mol/L

4
15×10-5mol/L

5
20×10-5mol/L

6
25×10-5mol/L

2.3清除羟基自由基能力的测定

实验编号
样品浓度
羟基自由基清除率
羟基自由基清除率平行
1
1×10-5mol/L

2
5×10-5mol/L

3
10×10-5mol/L

4
15×10-5mol/L

5
20×10-5mol/L

6
25×10-5mol/L

2.4清除H2O2能力的测定

实验编号
样品浓度
H2O2清除率
H2O2清除率平行
1
1×10-5mol/L

2
5×10-5mol/L

3
10×10-5mol/L

4
15×10-5mol/L

5
20×10-5mol/L

6
25×10-5mol/L