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第6章 肿瘤细胞的培养

肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：
(1) 可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。
(2) 既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变的发生机理；
(3) 可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。
(4) 可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。
(5) 研究周期短，比较经济。
但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养的生物学特性
1、形态和性状
形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。
2、生物特性
癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。
3、永生性
永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。
4、侵润性
侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。
5、异质性
所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分，肿瘤干细胞易于生长增殖，分离培养干细胞的方法称干细胞培养(有干细胞系和数个亚系组成)。
6、细胞遗传性
失去二倍体核型，呈异倍体或多倍体，常有标记染色体出现，正常细胞与恶性肿瘤细胞的区别，如表6-1所示。

表6-1 区别正常成纤维细胞与恶性肿瘤细胞的常用指标
指 标
正常成纤维细胞
恶性肿瘤细胞
形 态
棱形或多角形，伸展良好，折光较弱，核浆比例小，嗜碱性弱，核仁较少较小，多核巨细胞少见
多角形或细长形，伸展较差，折光强，核浆比例大，嗜碱性强，核仁多、大，常见多核巨细胞
生长特性
排列有方向性，单层生长，有接触抑制，饱和密度低
方向性消失，多层重叠生长，接触抑制消失，饱和密度高
粘 附 性
细胞间粘附性强，紧贴壁生长
细胞间粘附性弱，易脱落
血清的要求
必须有血清
无需血清能生长
在半固体琼脂中生长能力
不能生长
能生长，形成集落
电子显微镜观察
核蛋白体较少，微丝微管有规则排列
核蛋白体丰富，微丝微管消失
细胞膜对低分子物质通透性
粘多糖的合成和分泌腺苷酸
环化酶活性
细胞内CAMP浓度
低
多
高
高
高
少
低
低
对松孢菌素的反应
不刺激核分裂，或至多形成双核细胞

核持续分裂，形成多核巨细胞
致瘤试验
不能形成肿瘤
能形成肿瘤

二、培养肿瘤细胞的生物学特性的检测
体外培养的细胞一旦建立细胞系就需要进行一系列的细胞生物学特性鉴定，其目的在于：证明培养的细胞是否来自原来的肿瘤细胞。说明肿瘤组织类型。描述肿瘤细胞的生物学特性。通常要检查下列项目：
1、 组织起源
应说明培养材料起源于哪个胚层、器官组织、什么样供体、何种疾病等，必要时要提供病理诊断鉴定资料。
2、 形态观察
观察细胞一般形态如细胞形状，核浆比例倒置，有丰富的三极或多极有丝分裂，核仁清晰、多个，微丝、微管排列紊乱。
3、 细胞生长特点
检测细胞生长曲线，细胞分裂指数，倍增时间及细胞周期。癌细胞失去正常的接触抑制，呈多层生长，生长旺盛，倍增时间缩短，饱和密度大，分裂指数较高，具无限增殖能力，细胞浸润能力较强等。
4、 软琼脂培养
癌细胞在低密度下仍具有高度存活率，并在软琼脂中形成集落。
5、 细胞核型分析
检测核型特点，染色体数量，有无标记染色体，染色体带型等，癌细胞大多为异倍体，多倍体，并有标记染色体。
6、 动物致瘤试验 裸鼠背部皮下接种1×109~2×109/L癌细胞能生长形成实体瘤，其组织学形态与原发瘤相似。
7、 组织化学检查
癌细胞中脱氧核糖核酸、酸性磷酸酶和磷脂增多，碱性磷酸酶下降，乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性也改变。
8、 其他生物学特性检测
有凝集试验等。
三、肿瘤细胞的取材和培养
(一)肿瘤细胞的取材方法
培养肿瘤细胞的材料一般来自患者，对实体瘤患者可取原发肿瘤组织或转移灶，有胸、腹水患者可取胸水或腹水，白血病患者可取血液或骨髓液进行培养。
1、 实体瘤取材方法
取术后或活检标本，要尽早浸入无血清培养液保鲜，尽快进行培养。尽可能去除溃疡及坏死组织，避免细菌、霉菌污染，对取自外露的肿瘤组织应在培养前在含二性霉素B 2μg/mL，青霉素200～1000u/mL，链霉素500μg/mL的培养液中浸泡10～20分钟，再用洗液反复冲洗干净后，再作培养。
2、 体腔液的取材方法
在无菌条件下采取体腔液(胸水或腹水)，不需加抗凝剂，可直接以1200r/min收集细胞，不要久置，也不要在冰中冷却，而应尽早接种。
3、 血液(骨髓)取材法
白血病患者可取血液或骨髓，主要以取外周血为研究对象，用肝素抗凝的注射器无菌抽取5～10mL外周血，置于试管中立刻分离培养。
(二)肿瘤细胞的培养方法
肿瘤细胞对培养基要求不如正常细胞严格，一般常用RPM1640，DMEM、Mc-Coy-5A等培养基，血清浓度不高，10%即可，建议在原代培养时最好能加入生长因子或原患者血清(1%～2%)以利细胞生长，培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。原代细胞的培养方法如下：
1、 组织块培养法
将取得的瘤组织去除脂肪\结缔组织及坏死部分，在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1~2mm3小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，37℃ 5%或加盖瓶塞在普通恒温箱中培养。
2、酶消化法
在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或(2000u/ml胶原酶)在37℃水浴中消化30分钟(或更长一些)，去除消化液，用洗液洗3次，培养液洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。以5×108～10×108/L细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI1640(或Eagle MEM或DMEM)中37℃ 5% CO2下分瓶(或皿)培养。
3、钽网培养法
在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块(1~2mm3大小)，用镊子轻压，使其粘于网上，再把钽网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于37℃ 5% CO2下培养，每隔2~3天换液一次，5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。
3、脱落细胞法
将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗2次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶(或皿)中、37℃ 5% CO2下培养，每隔2～3天换液，7～10天上皮细胞逐渐长成单层。
在原代培养中，常在培养物中混有正常成纤维细胞，若把正常细胞误认为是癌细胞，就会使整个工作失去意义，若不及时去除这些成纤维细胞，由于它比肿瘤细胞生长快，最终能抑制肿瘤细胞的生长。因此，尽早排除成纤维细胞，已成为肿瘤细胞长期培养建系的关键，现已发现有许多因素能抑制成纤维细胞生长(见表6-2)。

表6-2 抑制成纤维细胞生长的因素
方 法
因 素

组 织 细 胞
选择性附着
胰蛋白酶
胶原酶
胚胎小肠、心肌表皮
乳癌
选择性附着底物
聚丙稀酰胺
聚四氟乙烯(Teflon)
胶原(猪皮)
各种肿瘤
转化细胞
表皮细胞
汇合饲细胞层
小鼠3T3
人胎小肠
表皮
正常和恶性乳腺上皮结肠癌
选择性培养基
D-缬氨酶(Valine)
MCDB-710
MCDB-153
Phenobarbitone
肾组织
乳腺
表皮
肝细胞
(三)成纤维细胞的排除方法
为了在肿瘤细胞中排除成纤维细胞，常采用五种方法，即机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法、密度梯度离心法。
1、机械刮除法
用不锈钢丝末端的橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插入不锈钢丝)或裹上少许脱脂棉制成，装入试管中高压蒸气灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。程序如下：
(1)标记 镜下观察，用记号笔在培养瓶(皿)的背面圈下肿瘤细胞的部位。
(2)刮除 弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶(皿)中，在肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记细胞空间。
(3)Hanks液冲洗1～2次，洗除被刮掉的细胞。
(4)加入培养基继续培养，如仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至彻底刮净为止。
2、反复贴壁法
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离。方法如下(同贴壁传代)：
(1)待细胞生长达一定数量后，倒去旧液，用0.25%胰蛋白酶消化后，Hanks液洗2次，加入不含血清的培养液吹打分散，制成单细胞悬液。
(2)取三个培养瓶分别编号为A、B、C，首先把细胞悬液接种入A瓶，置温箱中静置培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后，慢慢吸出全部培养物，再接种于B瓶中，然后向A瓶中补充完全培养基置温箱继续培养。
(3)B瓶中的细胞静置培养5～20分钟后，按处理A瓶的方法，把B瓶中的培养液和细胞悬液吸出并注入C瓶中，再向B瓶补加完全培养基，C瓶补加少量小牛血清(浓度为10%)。
三个瓶一并在培养箱中培养，如操作成功，次日观察可见A瓶中主要为成纤维细胞，B瓶中两类细胞混杂，C瓶中主要为上皮细胞(癌细胞)，必要时可反复处理几次直至癌细胞纯化为止。
3、消化排除法
此法曾用于乳癌细胞的培养，具体方法如下：
(1)先是用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次，然后加入新的混合液继续消化直到有半数细胞开始脱落时，立即停止消化。
(2)把消化液离心弃去上清，沉下的细胞用培养基重悬并吸入另一培养瓶中，置温箱培养，向原瓶中补加新的培养基继续培养，此法处理后，鉴于成纤维细胞比肿瘤细胞先脱落，原瓶中留下的多为肿瘤细胞，经过几次反复处理，就能把成纤维细胞除净。
4、胶原酶消化法
本法是利用成纤维细胞对胶原较为敏感的特点，通过消化进行选择。
(1)可用0.5mg/mL的胶原酶消化处理，边消化边在镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后即终止消化。
(2)用Hanks液洗涤处理一次后，更换新培养基，继续培养，可获纯净肿瘤细胞，若未清除净，可再次重复。
5、密度梯度离心法
用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重1.025～1.085的密度梯度分离液，加入细胞悬液后，2500r/min离心10分钟，在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重为1.065～1.085层为上皮细胞，将收集的上皮细胞经洗液3次后，进行培养可获纯净的肿瘤细胞。
最近，有人用SOD来抑制成纤维细胞的生长，这些方法都需进行预试验取得经验，找出适合条件，才能获得好结果。
(四)血癌细胞分离培养
1、 采血与分离白细胞
用肝素抗凝的注射器无菌抽取白血病患者外周血5～10mL，置无菌离心管中，斜放于37℃的水浴中，待红细胞沉淀后，将血浆部分吸入另一离心管中，以1500r/min离心15分钟，收集细胞，用含20%小牛血清的RPMI1640[含50u(μg)/mL青、链霉素]培养液调整细胞浓度至1×109细胞/L以上，开始接种浓度要大。培养基中加入患者血清为1%～2%。
2、原代培养物的维持：将分离的患者白细胞种入链霉素小瓶中，每瓶3mL在37℃温箱中进行悬浮状态的静置培养，每隔2～3天半量换一次，吸出1.5mL旧液弃去，加入新鲜完全培养基1.5mL。若换液前培养基中的pH有下降，说明细胞存活，起先一直坚持换液，不分瓶传代，直至细胞有明显增殖再扩大培养。
3、传代培养（直到建系）
细胞增殖后，pH下降明显时，说明细胞有明显增殖，此时摇动细胞，在细胞悬液中有少量细胞结成的团块，可转入传代培养，开始以1:2分瓶培养，当传至10代左右，细胞开始生长减慢，几乎不分裂，甚至有许多细胞死亡，此时再并瓶培养，坚持每3天换液一次，2～3周后细胞已适应了外界环境，开始增殖，然后每2天换一次液，每周传一代，即加入等量培养基以1:2分瓶培养，细胞增殖快时以1:3分瓶，即每瓶加入6mL，共计9mL，分成3瓶，每瓶3mL，继续培养，当传至20代以上时已基本稳定，可以认为已基本建系，我院共建了两个白血病细胞系，即S7811粒单型白血细胞系和S801急性淋巴细胞白血病细胞系。
(五)提高肿瘤细胞培养存活率和生长率的措施
根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能够传代的细胞系更为困难，当肿瘤组织或细胞初代培养后，常出现以下几种情况：
（1）完全无细胞游离出或移动。
（2）有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代。
（3）传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才呈现旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。
以上说明：肿瘤细胞原代培养时对体外生存条件有较高要求，并需经对新环境适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，必须采取特殊的措施。
1、适宜底物
把纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层或饲养细胞层等。
2、生长因子
将促进细胞生长因子加入培养基中进行细胞培养，常用胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其他生长因子。
3、动物体媒介培养
为了提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应和增加有活力的癌细胞(干细胞)的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率，受体动物以裸鼠最好。方法如下：
(1)瘤块接种 取新鲜瘤组织，用Hanks液洗净血污，切成1~3mm3小块，用穿刺针头吸一小瘤块，于皮下注入瘤块。
(2)待肿瘤生长达较大体积后剥取出瘤组织。
(3)进行体外培养。
(4)为防止失败，可取部分瘤细胞在裸鼠体内传代，通过裸鼠媒介接种，使肿瘤干细胞数量增多，细胞易于培养成功。
(六)肿瘤细胞体外培养应注意的事项
1、在原代培养时应注意的问题
(1)培养材料应取自肿瘤细胞集中、活力较好的部分，取材后应立即培养并存放于培养液中。
(2)取材和培养过程中要防止细菌和霉菌污染。
(3)培养物中混有的成纤维细胞要尽快清除。
(4)癌组织中若有淋巴细胞浸润，应采用密度离心法将淋巴细胞清除，否则癌细胞会被杀死。
(5)实验要防止其他细胞株的交叉污染。
2、在传代肿瘤细胞培养时应注意的问题
(1)当癌细胞没有生长到足够的量时，应耐心等待，坚持换液，不要急于传代。
(2)癌细胞经常重叠生长，如果混有成纤维细胞，应在传代时采用消化消除法及反复贴壁法加以清除，分离出癌细胞进行传代培养。
(3)在传到10代前细胞生长繁殖极不稳定，传代要小心，该合并培养时还得合并，千万不能传代。要确定适合该细胞的培养方法。
(4)在早期传代时要适当提高接种浓度。
(5)对于增殖能力极低的细胞，应放入饲养层中培养，并加入一些促生长物质，如胰岛素、氢化考的松、雌激素、EGF、软铁蛋白等因子。
(6)消除成纤维细胞始终为癌细胞培养中的重要条件，一旦发现应尽早尽快按上述介绍的方法加以清除。
七)人类恶性肿瘤连续性细胞系(株)的建系(株)标准
1、 共同特征
能在体外培养半年以上(或20代以上)，生长稳定，保持特性，能连续传代的，可称为连续性细胞系(株)。要具备如下原始资料：
（1）标本来源 要记录患者姓名、年龄、性别、临床诊断的疾病类别和分期。
（2）标本收集日期、细胞制作培养日期和方法。
（3）标本的病理切片和病理诊断，按组织学类型诊断。
(2)形态观察
①光镜观察 观察活细胞与染色细胞的肿瘤特征，细胞大小形态，排列，重叠多层情况，胞浆和核之比。肿瘤细胞的胞核大，胞浆少，核内呈不均匀性，核仁大而多。
②电镜观察：透射电镜观察肿瘤细胞的超微结构，如细胞外形不规则，有较多胞浆突或微绒毛。核形不规则，核膜凹陷显著,核内染色质不均匀分布,核仁大,胞质核糖体聚集。
(3)生长情况 如分裂指数、生长曲线、倍增时间、集落形成率和贴壁率、软琼脂中集落形成率。
(4)细胞表面改变 ConA或PHA凝集试验。
(5)染色体分析 如染色体数目、染色体分组配对、染色体分带，找出标记染色体。
(6)异种移植 用射线处理鼠或裸鼠作体内致瘤试验应能致瘤。
2、个别特征：有的有特殊抗原和受体标记，有的分泌特殊激素、蛋白。
3、细胞系(株)污染情况鉴定
(1)病毒 鉴定细胞是否存在有病毒，检查核中是否整合病毒基因，如EB病毒的核心抗原(EBNA)可在许多B淋巴细胞系、宫颈癌、鼻咽癌及白血细胞系中检出。
(2)支原体检查 检查方法有染色观察，培养法(牛心肌培养基示“荷色蛋”菌落及精氨酸代谢)、免疫荧光法、酶标法、放射自显影法及DNA或RNA的荧光显微镜检查法。
(3)细胞系(株)交叉污染的鉴测
①遗传学上用检测人Y染色体、染色体Q带、G带核型分析。
②免疫学上鉴定人类细胞HLA或免疫细胞的CD抗原分析。
③生物化学上鉴定同功酶的种特性及多态酶的表型差异性。
为了防止和避免细胞系间的交叉，有条件的单位应将器材、实验室、培养液分线操作或分开，切勿同时操作两种以上细胞。细胞库应首先建立检查细胞交叉污染的方法，一旦发现有交叉污染，应立即清理废除细胞，并发公告。