实验2 流动注射-化学发光测定眼药水中的盐酸环丙沙星.doc

实验2、流动注射-化学发光联用技术用于眼药水中的盐酸环丙沙星含量的研究

[实验目的]
1 掌握流动注射技术的基本原理以及化学发光分析法的基本原理
2 熟悉流动注射-化学发光分析系统的工作原理及仪器使用方法
3. 掌握流动注射化学发光法测量盐酸眼药水中盐酸环丙沙星含量的方法。

[实验原理]
化学发光(chemiluminescence)是指某些化学反应中发出可见光的现象。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物，中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁至激发态，然后从激发态回到基态，同时将能量以光辐射的形式释放出来，产生化学发光。

图1 化学发光发生的反应过程

直接化学发光 间接化学发光
流动注射技术（Flow Injection）：原始的手工操作和现代化的检测仪器共存，严重阻碍了先进检测仪器更好的发挥作用；同时分析过程中的试验处理往往占去整个分析时间的90%，这种状况自然不能满足现代分析化学的要求。流动注射法是为解决这一矛盾在70年代中期出现的溶液处理技术的新观念。其主要特点包括：①广泛的适应性：可与多种检测手段联用；②高效率：100-300样/h，复杂的分析过程也能达到40-60样/h; ③低消耗：10-100mL/测定；④高精度：0.5% - 1 %RSD,复杂的在线处理测定精度可达1.5%-3%RSD；⑤设备简单、价廉。
流动注射分析装置包括：液体传输设备；注样器；反应器；流通式检测器和信号读出装置。液体传输设备主要指蠕动泵；注样器是十六通注样阀；化学发光检测的反应器和流通式检测器合并为流通式盘管。
盐酸环丙沙星属于第三代喹诺酮类药物，抗菌能力强，临床广泛用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴菌引起的感染，对 内酰胺抗生素、氨基糖苷类以及四环素等多重耐药菌具有较好的抗菌活性。测定盐酸环丙沙星的分析方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、分光光度法 、电位法嘲、极谱法等。研究表明：在酸性条件下，盐酸环丙沙星对Ce4+-Na2SO3化学发光体系具有强的增敏作用，据此建立了盐酸环丙沙星的流动注射分析法。本方法具有分析速度快，仪器设备简单，灵敏度高等优点。用于盐酸环丙沙星滴眼液含量的测定，加标回收结果令人满意。

[仪器试剂]
BPCL微弱发光测量仪（中国科学院生物物理研究所）；HL-2D恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；八通阀（杭州）；联机计算机。
硫酸铈溶液：4.0 ´ 10-4 mol/L（用0.05 mol/l硫酸溶解）；亚硫酸钠溶液：8.0 ´ 10-2 mol/l；盐酸环丙沙星标准溶液：100.0 mg/L(用0.04 mol/l盐酸溶解)；盐酸环丙沙星滴眼液（规格5ml：15mg（按环丙沙星计）湖北东盛制药有限公司）
所用试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。
[装置和流路]

图1 流动注射-化学发光系统示意图
Figure 1 Diagram of Flow-injection -chemluminescence system
P. 蠕动泵(peristaltic); V. 六通阀(six-way valve); F. 流通池(flow cell); W. 废液(waste); PMT. 光电倍增管(photomultiplier); AMP.放大器(amplifier); HV.负高压(high voltage); REC.记录仪(recorder)。
[实验步骤]
1. 仪器预热
(1)接通计算机电源，启动windows 系统；打开BPCL主机电源，仪器预热30min以上，选择所需温度及负高压。打开快门（探测器样品室又下方旋钮：指示柄端头位于红色标记处，快门打开；绿色标记处，快门关闭）不能使探测器顶盖和快门同时处于开启状态，否则会损坏探测器中光电转换器！开启BPCL测量程序，设定参数后启动测量。
(2)清洗流路：开启蠕动泵，旋紧蠕动泵上面及两侧的4个旋钮（力度相同保证流速同一流速下的样品进样速度一致），选择蠕动泵转向（方向错误将导致蠕动泵卡住），打开蠕动泵，选择流速（可以用60rpm）。按图1组装流路，用0.1mol/l硝酸清洗流路，而后用0.1mol/l NaOH清洗流路，最后用二次蒸馏水清洗，直到基线稳定（基线信号值和所加负高压相关，当副高压为-750V时，基线在100单位化学发光信号为合适）。

2.数据测量
(1)用100.0mg/L(用0.04 mol/L盐酸溶解)的盐酸环丙沙星储备液，配置浓度为0.1-10mg/L的盐酸环丙沙星标准溶液系列。
(2)标准曲线的绘制：按图一流路测量，启动泵（流速为60rpm），将Na2SO3溶液与盐酸环丙沙星溶液混合后，通过流动泵注入作为载流的酸性硫酸铈溶液中，微弱发光仪检测及纪录发光强度信号。重新启动测量程序，开始检测。首先测量空白溶液，按相同时间间隔（15s）旋转八通阀，得到信号峰，平行测量三次，标准系列由稀到浓进行测量，操作同空白，得到一条时间-峰值图，完成检测后选择停止检测，保存，导出为.txt或.Xls文件后，导入origin处理。绘制浓度-峰值标准曲线，线性拟合得浓度-峰值关系式。
(3)盐酸环丙沙星滴眼液（规格5ml：15mg（按环丙沙星计）湖北东盛制药有限公司），按标示稀释为10mg/L的浓度，按（2）操作先走空白，空白的峰值和标准曲线相近，测量理论浓度为10mg/L（按环丙沙星计）的眼药水，均平行测量三次，完成检测后选择停止检测，保存，导出为.txt或.Xls文件后，导入origin处理。读出峰值，按浓度-峰值关系式求出眼药水中的实际盐酸环丙沙星含量。
3.清洗流路
(1)清洗流路（同上面方法，最后将管中二次蒸馏水全部走光，保证管不被腐蚀），关闭快门旋松蠕动泵旋钮，关闭BPCL主机。
(2)关闭电脑，洗净试剂瓶，容量瓶，清洁台面，关闭实验室电源方可离开。

[实验数据]
1 静态法测动力学曲线
采用分立取样式，研究该体系的化学发光反应动力学曲线，即记录在反应物部分混合后，发光强度随时间的变化曲线。观察化学发光强度随时间的变化情况。

2 体系条件优化
2.1硫酸铈浓度的影响
固定Ce4+溶液里的含硫酸浓度为0.05 mol/L，流速60 rpm，Na2SO3浓度为8 ´ 10-4 mol/L，分别在空白10 mg/L的条件下考察Ce4+溶液浓度在1 ´ 10-5 ~ 5 ´ 10-3 mol/L 范围内变化对体系信号的影响。

2.2亚硫酸钠浓度的影响
固定Ce4+浓度为5.0 ´10-4 mol/L（含硫酸浓度0.05 mol/L），流速60 rpm，分别在空白和10 mg/L的条件下考察Na2SO3在1.0 ´ 10-4 ~ 1.0 ´ 10-1 mol/L 范围内变化时对信号值的影响。

2.3硫酸介质浓度的影响
固定Ce4+浓度为5.0 ´10-4 mol/L，管长和流速60 rpm，Na2SO3浓度为8 ´ 10-4 mol/L，分别在空白和10 mg/L的条件下考察Ce 4+溶液里硫酸含量从10-3 ~ 10-1 mol/L 范围变化时对发光信号值的影响。

3校准曲线、精密度和检出限
在选定的最佳条件下，测量相对发光强度与盐酸环丙沙星浓度在0.10 mg/L~15 mg/L范围的关系，作出线性关系图，拟出回归方程。对1.00 mg/L盐酸环丙沙星标准溶液平行测定11次，求出相对标准偏差，计算出检出限。

4 实际样品测定
取盐酸环丙沙星滴眼液,（按标示量）用二次蒸馏水稀释为不同的浓度为样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，采用该实验方法测定其含量，同时进标准加入回收实验。计算含量测定值，加标回收率及标准偏差结果以三线表形式列出。

试样
眼药水稀释液测得量mg*L-1
加标量mg*L-1
测得总浓度mg*L-1
回收率%
RSD%
Ⅰ

1

3

5

Ⅱ

2

4

6

Ⅲ

1

3

7

【注意事项】
(1) 使用前一定要清洗流路，使基线值足够低和稳定。
(2) 调整合适的负高压和温度，温度控制器：由于热量是从加热器向样品传导，样品的热量向环境散发，所以样品实际温度要低于加热器温度。视环境温度不同差值在2~4℃。
(3) 负高压的选择：查看标准光源计数率与高压关系曲线，找出光源计数率为10000/秒到30000/秒的区域为合适，选取此范围内的某一负高压值。
(4) 测量完标准曲线后要也重新走空白是其峰值和标准曲线时的空白相近才可以测量眼药水中盐酸环丙沙星的含量。

[思考题]
(1) 化学发光和其它分子发光（荧光、磷光）的有什么异同点？
(2) 为什么测量完一系列标准样品溶液后要走空白到基线值相近才可以测量眼药水中样品的浓度？
(3) 与其它测量盐酸环丙沙星的分析方法相比，本实验方法有何优缺点？
(4) 流动注射法的意义，以及十六通阀的作用是什么？

附件：

BPCL-微弱发光测量仪操作规程（流动注射法）
1 接通计算机电源。
2 启动windows 系统。
3 打开BPCL主机电源，仪器预热30min以上，选择所需温度及负高压。
4 打开快门（探测器样品室又下方旋钮：指示柄端头位于红色标记处，快门打开；绿色标记处，快门关闭）不能使探测器顶盖和快门同时处于开启状态，否则会损坏探测器中光电转换器！
5 开启BPCL测量程序，设定参数后启动测量。
6 开启蠕动泵：旋紧蠕动泵上面及两侧的4个旋钮（力度相同保证流速同一流速下的样品进样速度一致），选择蠕动泵转向（方向错误将导致蠕动泵卡住），打开蠕动泵，选择流速（可以用60rpm）。
7 清洗流路：用0.1mol/l硝酸清洗流路，而后用0.1mol/l NaOH清洗流路，最后用二次蒸馏水清洗，直到基线稳定（基线信号值和所加负高压相关，当副高压为-750V时，基线在100单位化学发光信号为合适）。
8 重新启动测量程序，选择合适流速进样，开始检测。
9 按相同时间间隔（15s）旋转八通阀，得到类似的信号峰。
10 完成检测后选择停止检测，保存。
11清洗流路（同上面方法，最后将管中二次蒸馏水全部走光，保证管不被腐蚀），关闭快门旋松蠕动泵旋钮，关闭BPCL主机。
12 导出为.txt或.els文件后导入origin处理。
13 关闭电脑。

温度控制器：由于热量是从加热器向样品传导，样品的热量向环境散发，所以样品实际温度要低于加热器温度。视环境温度不同差值在2~4。C。
负高压的选择：查看标准光源计数率与高压关系曲线，找出光源计数率为10000/秒到30000/秒的区域为合适，选取此范围内的某一负高压值。

2 恒流泵

工作原理：

3 十六通注样阀