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1、 ※ 热原检查法 药检文摘日期:2004-8-11 热原检查法 1绪言 热原也称为发热性物质（日本药局方）''英文叫做Pyrogen，即能够引起恒温动物体温异常升高的物质总称。 与注射剂有关的发热性物质研究可追溯到16世纪。直到18世纪丹麦生理学家panum的研究中断定，“发热物质是一种对热稳定，溶于水，不溶于乙醇，由活的细菌中来的一类物质，而且微量静注后就能引起高热反应”。 1923年，Seibert肯定地证实了所有注射剂的发热原因是通过革兰氏阴性菌所产生的一种可滤过的高热稳定的热原污染结果。随后Rademaker进一步证实了Seibert的发现，并进一步强调避免细菌污染
2、的重要性。之后的共同研究确立了使用家兔检测注射剂及水中致热物质的方法。 这个结果导致了官方的重视，20年后，美国药典于1942年USP12）进行了收载''其后，各国药典相继收载，CHP→1953年''BP→1953年''JP→1951年第6版药局方''半个多世纪来，热原检查法在保证注射剂的安全用药方面发挥了重要作用。 2热原与热原反应 热原即发热性物质，目前普遍认为是由革兰氏阴性菌所产生的内毒素（脂多糖），广义说，是所有引起恒温动物体温异常升高物质的总称。 除内毒素引起发热外，还包括病毒，干扰素以及其它种种发热物质。 热原反应是指临床输液反应，如果将携带超量热原物质的注射液静脉输入人
3、体，通常在05-2h内引起机体严重的临床反应。表现为：机体外周皮肤血管收缩，停止排汗，散热减少，发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐，严重时可出现昏迷、休克、死亡等一系列临床症状，体温通常可上升至40℃左右。 3热原的本质 在自然界，热原分布很广，可以说无处不在，无处不有，关于热原本质的研究，目前在世界范围内，主要存在二种观点。 一种观点是：热原的本质就是革兰氏阴性-菌所产生的细菌内毒素，就注射剂来讲，其输液反应主要来源于细菌内毒素。 另一种观点是：热原可能是一类能刺激哺乳动物巨噬细胞MQ所产生的细胞分裂素Cytokines的物质的总称。所谓细胞分裂素是一类内源性物质（包括：白细胞介
4、素1，白细胞介素6TNF等）和干扰素类。这些内源性的热原质可直接作用于大脑中枢神经系统刺激体温中枢，最后使机体发热。 4、内毒素分子结构 （略） 5、细菌毒素（内毒素与外毒素）性质与特点 一般细菌毒素分为两类，一类为外毒素Exotoxin）是一种毒性蛋白质，是细菌生长过程中分泌到菌体外的毒性物质，产生外毒素的细菌主要是G—白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌，另一类为内毒素endotoxin），是革兰氏阴性 菌细胞外壁层上的特有结构，细菌在生活状态时不释放出来，只有当 细菌死亡自溶或粘附在其他细胞时，才表现出毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中类脂A成
5、分。 外毒素的性质与特点： ·毒性强·具有抗原性 ·无发热性·细菌的代谢产物 ·单纯蛋白质、易分解破坏，对光、热、酸碱不稳定 内毒素性质与特点: ·强的发热性·细胞壁上特有结构 ·毒性作用弱·抗原性弱 ·核酸多糖的高分子聚合物，不易破坏 ·耐热性·对酸、碱不敏感 ·水溶性好，生物活性强 6、细菌内毒素的生物活性 细菌内毒素在机体水平上的生物活性表现在以下方面： ·发热性·致死毒性·体重减少 ·Shwartzman反应·骨髓反应·白血球减少 ·血小板减少·非特异的感染防御（nonspecificresitance） ·耐受性（tolerant）·辅药作用（adju
6、vant） ·寒颤（血压低下，血管内凝固） 7热原的物理化学特性： 1耐热性： 我们知道细菌内毒素除了具有各种生物活性外，还具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，需250℃30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为180℃2小时或250℃30分钟以上，而日本药局方第十三改正为250℃1小时以上。其它各国药典也大都如此，据国外文献报导，当对细菌内毒素的水溶液，在不同温度下保温处理后进行检测，发现其内毒素活性在200℃1小时时还能检测出来。而只有当加热到250℃1小时才能完全灭活，国内细菌内毒素标准品的耐热情况虽然未能
7、考察，但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用250℃1小时以上的干烤处理。 由于热原的种类繁多，耐热性不完全相同，一般含脂多糖结构的耐热性强，含蛋白质成份耐热差。 2滤过性 体积小，1-50mu间，可通过滤器，但不能通过透析膜或过滤板。 3水溶性：易溶于水，不溶于有机溶媒 4不挥发性：不易挥发，但能随水汽雾头夹带入蒸馏水中 5被吸附性：可被吸附剂吸附，如活性炭等。 8除去热原的方法： 实验用具：250℃30分钟以上，1802hr以上。 JP250℃1h以上，其它药典也如此。 样品：湿热（高压蒸气流）处理，过滤：薄膜过滤后渗压法。 其他：酸碱破坏法 9、检
8、测热原的方法 家兔法-热原检查法 化学方法－BET法 生物学方法—TL－Ⅰ，TL－Ⅱ等的测定 其他方法－免疫测定方法ELISA法等 常用的化学方法BET，是最近20年来发展最快的方法、BET法的优点是方便、快捷、灵敏、经济、克服了生物测定的误差。USP2000年24版，600多种，中国药典2000版69种，还在做工作，5年后估计200种左右。 10、中国药典热原检查法： 中国药典98增补本、2000年版较1995年版以前，热原检查法有较大的修订。 2000年版药典附录IXD热原检查法 本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试
9、品中所含热原的限度是否符合规定。 供试用的家兔应健康无伤，体重17-30kg，雌兔应无孕。预测体温前7日即应用同一饮料饲养，在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等有得有异常现象。未经使用于热原检查的家兔；或供试品判定为符合规定，但组内升温达06℃家兔；或三周内未曾使用的家兔，均应在检查供试品前3-7天内预测体温，进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔30分钟测量体温1次，共测8次，8体温均在380-396℃的范围内，且最高最低体温的 差数不超过04℃的家兔，方可供热原检查用。用于热原检查后的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息2日方可供第2次检查用。如供试
10、品判定为不符合规定，则组内全部家兔不再使用。每一家兔的使用次数，用于一般药品的检查，不应超过10次。 试验前的准备在作热原检查前1－2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室的温度应在17－28℃，在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3℃，应避免噪音干扰。家兔在试验前至少1小时开始停止给食并置于适宜的装置中，直至试验完毕。家兔体温应使用精密度为±01℃的肛温计，或其他同样精确的测温装置。肛温计插入肛门的深度和时间各家兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于1分半钟，每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过02℃，以此两次
11、体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用家兔，正常体温应在380－396℃的范围内，且各兔正常体温之差不得超过1℃。 试验用的注射器、针头及一切和供试品溶液接触的器皿，应置烘箱中用250℃加热30分钟或用180℃加热2小时，也可用其他适宜的方法除去热原。 检查法取适用的家兔3只，测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38℃的供试品溶液，然后每隔30分钟按前法测量其体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数。如3只家兔中有1只体温升高06或06℃以上，或3只家兔体温升高均低于06℃，但升高的总数达14℃或14℃以上，应另取5只家兔
12、复试，检查方法同上。 结果判断在初试3只家兔中，体温升高均低于06℃，并且3只家兔体温升高总数低于14℃；或在复试的5只家兔中，体温升高06℃或06℃以上的兔数仅有1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总数为35℃或35℃以下，均认为供试品的热原检查符合规定。 在初试3只家兔中，体温升高06℃或06℃以上的兔数超过1只；或在复试的5只家兔中，体温升高06℃或06℃以上的兔数超过1只；或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总数超过35℃，均认为供试品的热原检查不符合规定。 主要修订内容： 1、如供试品判定为不符合规定，则组内全部家兔不再使用。 2、每隔30分钟测量体温一次，共6次。
13、 11热原检查法的建立及优缺点 ·建立 1953年中国药典收载，选用家兔试验的原因，主要根据以下实验结果： 马、狗、猫、猴子给予内毒素时，同人一样有发热反应 大鼠、小鼠、豚鼠、鸡小动物给予内毒素时，发现重复性很差，尤其大、小鼠。而且存在依赖性，体温下降等情况，温度不稳定，可能会出现假阳性结果。 由于狗有稳定体温调节，其发热反应敏感性比家兔低，而且有白细胞减少、呕吐、拉稀等细菌内毒素特有的毒性反应。 所以认为家兔最适合于作为检查： ①家兔与人类的所引起的发热反应的最小内毒素量几乎相当（01ng/kg） ②家兔有繁殖容易、使用、注射方便等优点。 ·优缺点： 优点： ·热原
14、检查法可以反应动物复杂的升温过程 ·不仅内毒素，对内毒素以外的热原也能检测出来。 缺点： ·个体差异·重现性、灵敏度差 ·不易定量·受药理活性及理化性能影响大 ·数据零散 ·实验动物的饲养，费用高，时间长 ·爱护动物方面 ·实验方法差异（USPJPEPBP） ·干扰因素多 12热原检查法的应用范围 1各种注射剂的成品检测（大输液、小针剂） 2生产过程中中间步骤的内毒素控制 3抗生素类、生化药品类 4新品种、输血、输液用品 5血液制品 13、热原检查法的进展及替代 热原检查法进展： 热原检查法自1942年USP12版收载以来，其方法学的研究一直在进行着，最有影
15、响力的是1990年美国药典委员会、FDA进行的一次协作研究，对以下几个方面进行了考查： ·升温间隔时间 ·不同的内毒素升温情况 ·升温限度等 以上协作结果成为USP22（93）第8本修订本热原试验的依据。修订为： ·测温间隔时间由1小时改为30分钟 ·致热限值由06降至05℃ 另外，在欧美日各国，从爱护动物的观点出发，在药典中的试验尽可能的避免使用动物，而采用invirto（体外）替代方法，如细菌内毒素检查法是最近20年建立起来的替代家兔法检测热原的一种新的方法，该方法灵敏、快捷、方便、经济，美国科学新闻1980年曾这样报道细菌内毒素检查法“一种简单的检测强烈的细菌内毒素的试验可
16、以节约时间、金钱和许多小兔子”。 但热原检查法作为一种经典方法，几十年来为保证药品安全检查方面发挥了重要作用，功不可没，现在各国药典还保留着。 USP使用动物试验消减变化情况 USP21 USP22 USP23USP24 品种数 404 70 34*23 占有比例112 19 0905 14各国药典方法比较 随着热原检测方法的不断发展，新的更加灵敏的测定方法也已普通采用，然而到目前为止，JPUSPEP以及中国药典附录中也都还保留着热原检查法，也就是说，在一定时间内，热原检查法依然是检测热原的一个手段和工具。现将四国药典中热原检查法的判断基准对比如下： CP95年版 第一次实验
17、3只家兔 注射后有2~3只家兔体温上升06℃为阳性 注射后有1只家兔体温上升06℃或3只体温上升总和超过14℃进行复试 第二次实验5只家兔 注射后体温上升06℃有两只家兔以上或初、复试8只家兔升温总和超过35℃时为阳性 JP13版 同CP95年版 USP23版 第一次实验三只家兔 所有家兔升温值在05℃以下时为阴性 升温值在05℃以上时再取5只家兔复试 第二次实验8只家兔 8只家兔中，升温值超过05℃3只以下，总和在33℃以下时为阴性 EP3rdED 首先取1组3只家兔进行实验，结果3只家兔升温总和若在判定基准表A温度值以下时为合格，超过表B温度值时为不合格
18、若在之间再取一组3只家兔进行实验，以两组6只家兔进行统计，按上述方法计算结果，如有必要，按规定最多取4组家兔进行实验 判定基准表 家免数AB 合计温度在以下为合格合计温度在以上为不合格 3115℃265℃ 6280℃430℃ 9445℃595℃ 12660℃660℃ 15临床混合用药输液反应问题 注射剂应用的早期，由于品种单一，热原能很好的控制，也容易查找原因，随着制药工业的发展，注射剂的种类及数量愈来愈多，抗生素、小针剂、生化药的出现，二种或以上的注射剂混合用药越来越普遍，则造成临床的输液反应更为复杂，其监控问题也更加突出，目前，尚无一个标准很好的控制。 临床输液
19、反应有三个方面的因素影响： 1注射剂中热原值过量或混合后超过限值（热原有累加性） 2输液用具的污染 3个体差异 以上以混合后情况最为复杂。 16药品的降温问题及处理 引起家兔降温的原因： 1药品本身具有降温作用或药品生产过程中带入能引起降温的物质，如喹诺酮类、能引起普遍降温。如含Ca的制剂，有时也降温（所以药典规定缓慢注射），又如乳糖酸红霉素也能引起降温反应。 2家兔体质不佳，腹泻，肛门松弛，体重较小或有外伤。 3实验环境变化的影响，如室温或温度变化较大。 4注射速度快，药液的温度较低（尤其冬季影响更大） 在中国药典1985年版附录生测部分草稿审定会上，对降温问题作了
20、重点讨论，处理意见是： （1）如果是药的问题，注射速度减慢。（2）如果环境问题，兔子问题，则控制环境温度，挑选健康无伤的兔子，再试。 （USP降温以“0”计）， 17、影响热原试验结果的因素： 药品本身对实验结果的影响 使家兔体温降低的样品：乳酸钙Ca、喹诺酮类等 剂量、浓度、速度的影响 剂量大、浓度大、速度快易引起家兔体温下降或异常。 大剂量的高渗药物，可引起红细胞干瘪、缩小，失去正常的携氧功能。 大剂量低渗药物，可引起红细胞充胀破裂，发生溶血现象，同时，使排泄增加，使家兔短时内降温。 体积大的等渗水也可使体内血液循环量突增，大大超过生理负荷，严重时可使心脏破裂而死亡。（
21、仍以一般药品规定最大体积10ml/kg）（剂量设置要综合考虑，根据该药的药理作用、理化特性、临床用药剂量、在不影响家兔体质的前提下，可考虑按临床一次量的3-5倍，最低不低于2倍）。 速度过快：会引起血压下降，休克、死亡。如氯化钙、氯化钾、枸橼酸钠、ATP、硫酸镁、碳酸氢钠）等。 浓度大的药物需稀释后注射。 家兔对实验结果的影响 （1）品种：一般用大耳白、新西兰兔，不能用安哥那长毛兔 （2）环境：应符合要求 湿度，通风排水设备，空气中消毒粒子，安静舒适环境很重要。T：17-28，氨气：20PPM以下，湿度40-80，光照150-300lx，噪音70分贝以下。 （3）饲养管理：实验室
22、与饲养间分开，专用的固定设施。 （4）疾病：问题动物及时处理 （5）兔龄与体重： 一般认为：较轻的不恒定，较大不敏感，不超过30kg，各国药典要求最低15kg以上。复试时严格些，20-24kg。也有实验证明体重不影响温度。 （6）原始体温高低的影响： 高→不敏感 低→易升温，使复检率上升，应注意，规定每次实验中各兔体温之差不超过1℃。 （7）进食同体温的关系 95版规定，试验前至少1小时停止进食。 2000版规定，试验前至少1小时停止进食。 BP（1988，1993）隔夜禁食，实验期禁水。 USP22版禁食不禁水（实验过程）。 JP（XI）实验前数小时开始禁食。 一般
23、认为：试验前不禁食，体温上升 有报道：当日不禁食，温度稳定，但饥饿过久，血糖下降，产 热量下降，体温下降。 所以实验前喂食1次较合适。 （8）对热原的敏感性 兔子对热原的反应较敏感，但体温调节机构不稳定，正常体温幅度变化大，随着使用次数的增加，对热原的耐受性增高，复试时，挑选试验次数少的进行试验。一般规定不超过10次。 （9）测温时间长短的影响 有试验证明：70s120s结果相同，30s时，1/5的动物达到120s的体温。 （10）其他因素的影响 1）刺激与扰乱2）动物来源及种类 3）外伤，如耳号4）探头的长度及深度（6cm） 5）校正探头6）家兔档案的记录，以利于分析不
24、正常结果。 18其他注意 1、固定方式 2、血液制品 3、动物购买 4、复试问题 异常毒性检查法 中国药典2000年版附录ⅪC： 本法系将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或口服给药。在规定的时间内观察小鼠死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法。 对动物的要求： ·健康、合格、体重17-20g ·试验前及试验观察期均按正常饲养条件饲养 ·作过本试验的小鼠不得重复使用 对样品溶液配制的要求： 除另有规定外，用氯化钠注射液按各药品规定的浓度配制供试品溶液。 实验材料和用具 ·天平 精度001或01mg供试品称量用 精度01或1mg试剂称量用 精度0
25、1g小鼠称重用 ·试验用具：小鼠固定装置（固定器、支架或盒子） 注射器（1ml以下，精度001ml）、大称量瓶、吸管、移液管、小烧杯 ·试剂：75乙醇，棉球，氯化钠注射液，其他规定的溶剂。 供试品溶液 ·原料药 精密称取适量，置适宜容器中，按规定浓度，加精密量取的一定量溶剂，搅拌使溶解 ·注射液 用75乙醇棉球消毒安瓿颈下或瓶塞，按规定浓度，加精密量取的一定量溶剂，混匀。 ·粉针剂 用75乙醇棉球消毒安瓿颈部或小瓶瓶塞，加入一定量规定的溶媒配成所需浓度 检查法： 除另有规定外，取上述小鼠5只，按各药品项下规定的给药途径，每只小鼠分别给予供试品溶液05ml。 给药途
26、径： ·静脉注射--注入尾静脉，应在4-5秒匀速注射完毕 ·腹腔注射--注入小鼠腹腔 ·皮下注射--腹部或背部两侧皮下 ·口服注射--通过适宜的导管，灌入小鼠胃中（常用灌胃针头） 静脉注射给药方式（见图片） ·置小鼠固定器中，使尾巴暴露在外。 ·75棉球擦拭尾注射部位，注入药液。 ·注射速度4-5秒（注意：如注射部位发白且推入药液有阻力，表示针头未推入静脉内，应重插，如药液损失，应另取小鼠注射。 ·注射完毕后，拨出针头，止血（棉球），观察即时反应（现注重即时反应，有反应也应记录下来） ·共注射5只小鼠 腹腔注射（图片） ·一手握小鼠，用拇、食指捏住小鼠颈背部，用无名指及
27、小指固定其尾及后肢，腹部向上。 ·用75乙醇拭擦小鼠腹部（或背部）注射部位 ·腹腔注入供试品溶液 ·注射完毕后，拨出针头，放鼠盒中，观察即时反应，共注射5只小鼠，正常饲养。 皮下注射 ·握小鼠，同腹腔注射法 ·消毒腹部或背部注射部位 ·皮下注入样品溶液，可见注射部位皮下出现泡状隆起。 ·其它同上。 口服给药：（图片） ·握小鼠，同腹腔注射 ·用右手捏鼠尾，移至笼子盖或台上将尾向后拉，小鼠会反射性的向前伸。然后用左手的拇指和食指抓住颈部上提，手掌和小拇指夹位臀和尾部。将左后肢夹在左手的无名指和小拇指之间。动物的全身，特别是从颈部到胸部笔直地伸展开来。 注意点：不要过分地按
28、颈部 ·将胃管的前端插入小鼠口腔，与体轴保持平行慢慢插入。 ·导管的前端到达咽喉部时感到略有抵抗感，这时，将导管的前端稍偏向腹侧就可进入食道。 ·注意小鼠无呼吸困难的征兆，送入导管，无抵抗感可顺利插入。 ·将注射器内药物缓慢注入（图47） 注意点：一般小鼠灌胃针头进入2/3-3/4可进入胃部。 给药完毕，拨出针头，放入盒中，观察即时反应5只，正常饲养。 结果判断： ·除另有规定，5只小鼠在给药后48小时不得死亡。 ·如有死亡，另取18-19g小鼠10只，复试；48小时 内全部小鼠不得有死亡。 ·常见药典品种毒性分析 ·影响毒性试验的因素 1、速度与毒性的关系 2
29、给药途径与毒性的关系 3、禁食与毒性的关系 4、体重与毒性的关系 5、性别与毒性的关系 6、饲养条件与毒性的关系 7、温度与毒性的关系 8、给药时间与毒性的关系 不同动物不同途径常用容量和最大体积 给药途径小鼠大鼠豚鼠兔狗 ig02-101-41-55-1010-100 ip02-101-32-55-105-15 im01-0202-0502-0505-12-5 iv02-051-21-53-1035-50 sc01-0505-105-21-33-10 报告书应有的内容： 检品名称检品分类 供样单位规格 生产单位包装 批号失效日期 检验目的检品数量 检
30、验依据报告日期 检验日期室温、湿度 检验者审核者 实验动物、来源性别体重 药液配制给药途径 给药剂量结果 结论 过敏试验 全身过敏反应：（原理） 过敏反应是免疫反应的一种特殊表现，当药物作为抗原或半抗原（半抗原在体内与蛋白质结合形成抗原）初次进入体内通过免疫机理、刺激机体产生相应的抗体。当同样的药物再次进入机体内、抗原与抗体形成抗原抗体复合物，导致组织细胞损伤、肥大细胞释放组织胺等物质，从而引起局部水肿、抓鼻、竖毛、呼吸困难、窒息、痉挛、死亡等。 材料 1动物－豚鼠2器械－注射器3药品－供试品 方法 豚鼠（健康无伤）6只，体重：250-350g或200-300g
31、 操作：无菌（消毒注射器） 给药时间：致敏：隔日一次，共三次 攻击：第１４、２１天，各1/2动物。 剂量：致敏：05ml／支（ip） 攻击：10ml／只''2ml／只或腹腔２－３ml 攻击给药部位：耳静脉、阴茎静脉、后肢小隐静脉。 结果判断： 豚鼠反应级数 反应级数反应症状 ０无明显反应 １只有轻微抓鼻、颤抖或竖毛 ２有几次咳嗽、有抓鼻、颤抖或竖毛 ３多次或连续咳嗽，呼吸困难或痉挛、抽搐等 ４痉挛、抽搐、大小便失禁、休克死亡 结果判断 不合格：二级以上（包括二级） 豚鼠特点、品种、饲养管理、常见病 1豚鼠CaviaParcellus''Quinepig）又
32、名天竺鼠、荷兰猪。产地：欧洲，属于哺乳GANG 分短毛、长毛、刚毛三种 2性情 温顺、胆小、不咬人不抓人 听觉和嗅觉发达 出生后片刻能活动：2－5天离笼饲养 寿命：6－8年成熟：4－5月♀5－6月♂ 孕期：62－72天产仔：3－5胎／年，1－6只／胎 3豚鼠体重与年龄的关系 体重g 年龄 雄雌 初生5580 1日100120 2月150200 3月200280 4月300350 5月350400 1年750800 常用品系： 1近亲系目前世界上有12个 2短毛英国种： 我国较多单位使用：英国种豚鼠杂交形成被毛颜色多样的非纯种短毛豚鼠。 3安哥拉种、
33、秘鲁种、北西厄亚种－抵抗力差－易污染疾病，不宜用做实验。 饲养管理 1喜欢生活在清洁，凉爽和安静的环境中。 2白天活动，夜间少食少动。 3易在寒冷环境中发生肺炎。 4食草动物。体内不能合成维Ｃ，必须给新鲜蔬菜或混合饲料或者从 水中加入维Ｃ。 ∷过敏反应的四种类型 1、速发型 2、细胞毒型 3、免疫复合型 4、迟发型 ∷易引起过敏的药品 ∷已报道的中药过敏品种 ∷过敏反应应注意的问题 降压物质检查法（附录ⅪG） 本法系比较组胺对照品S与供试晶T引起麻醉猫或狗血压下降的程度，以判定供试晶中所含降压物质的限度是否符合规定。 组胺对照品溶液的配制精密称取磷酸组胺对照品
34、适量，按组胺计算，加水溶解使成每lml中含10mg的溶液，分装于适宜的容器内，4—8℃贮存，如无沉淀析出，可在3个月内使用。 对照品稀释液的配制临用前，精密量取组胺对照品溶液适量，用氯化钠注射液配成每lml中含组胺05μg的稀释液。 供试品溶液的配制按正文规定的剂量，配成适当浓度的供试品溶液；试验时，一般要求供试品溶液与对照品稀释液的注入体积应相等。 检查法取健康合格、体重2kg以上的猫或体重5kg以上的狗，雌者无孕．用适宜的麻醉剂如巴比妥类麻醉后，固定于保温手术台上，分离气管并插入插管以使呼吸畅通．必要时可行人工呼吸．在一侧颈动脉插入连接测压计的动脉套管，管内充满适宜的抗凝剂溶液，以记
35、录血压，也可用其他适当仪器记录血压。在一侧股静脉内插入静脉插管，供注射药液用。试验中应住意保持动物体温。全部手术完毕后，将测压计调节到与动物血压相当的高度一般为133～160kPa，开启动脉夹，待血压稳定后，即可进行药液注射．各次注射速度应相同，每次注射后立即注入一定量的氯化钠注射液，相邻两次注射的间隔时间应一定3—5分钟，每次注射应在前一次反应恢复稳定以后进行。自静脉轮流注入上述对照晶稀释液，剂量按动物体重每lkg注射组胺005μg、01μg及015μg，每个剂量应各重复2～3次，如01μg剂量所致的血压下降值均不小267kPa，同时相应各剂量所致反应的平均值有差别，可认为该动物的灵敏度符合
36、规定。 取对照品稀释液按动物体重每lkg注射组胺o1μg的剂量ds，供试品溶液按正文中规定的剂量dr，照下列次序注射一组4个剂量：ds、dT、dT、ds，。然后以第一与第三、第二与第四剂量所致的反应分别比较;如dT所致的反应值均不大于ds所致反应值的一半，即认为供试品的降压物质检查符合规定。否则应按上述次序继续注射一组4个剂量，并按相同方法分别比较两组内各对ds、dT剂量所致的反应值；如dT所致的反应值均不大于ds所致的反应值，仍认 为供试品的降压物质检查符合规定；如dT所致的反应值均大于ds所 致的反应值，即认为供试晶的降压物质检查不符合规定；否则应另取动物复试。如复试的结果仍有dT的
37、反应值大于ds所致的反应值，即认为供试品的降压物质检查不符合规定。 所用动物经灵敏度检查仍符合规定，可继续用于降压物质检查。 二、操作规程（猫血压法） 1实验材料及用具2溶液配制 3实验动物4检查法及实验操作 5结果判断6试验记录格式及要求 7技术要点及注意事项 （1）组胺标准品的配制，应注意计算组胺的实际重量（mg）称取重×0362实际组胺重量 ·称重时，减量法，注意玻璃屑不要落入。 ·第1次配制时，配制成1mg/ml的组胺溶液，用注射用水或蒸馏水配制，可置冰箱保存，三个月内如无沉淀、浑浊，可用。实验前取 1ml（1mg/ml）→50ml20ug/ml 再取25ml20
38、ug/ml→100ml（05ug/ml，（用生理盐水配制） （2）麻醉 120mg/kg苯巴比妥钠 15ml/kg戊巴比妥钠 30ml/kg戊巴比妥钠（无苯巴比妥钠时） （麻醉时：腹腔注意不要注入膀胱，否则吸收差，达不到麻醉目的） （3）体温 天气冷时，要加温。 （4）气管：样品较少时，可不需切开气管 （5）动物：怀孕动物不宜用 （6）灵敏度测定： 005μg/kg01μg/kg015μg/kg 体积02ml/kg，静脉给药，用05-10ml生理盐水冲洗。 （7）对样品体积的要求 配制时同标准品，将样品每kg应注入的量配在02ml溶液中。 （特殊情况，如氨基酸、大
39、输液及其他，则可根据具体要求，一般不超过1ml/kg。） （8）给药顺序： S1T1T2S2（T1同S2比，T2同S1比）， 如有T超过S1/2，按S1T1T2S2，S3T3T4S4顺序做八针 （9）结果判断： T均小于S的1/2，则符合规定， T均大于S，则不符合规定 如T有超过S1/2，复试T均小于S，则符合规定 （10）一只动物使用次数 只要灵敏度符合规定，可继续进行 （11）复试条件： 有部分dt所致的反应值大于ds，则另取动物复试 ∷新药研究中安全性项目剂量的确定； ∷新药标准中安全性项目易出现的问题； ∷替代法的应用 程序维护:湖北省药检所网站
40、 湖北省药检所网站 >> 返回上一页 内毒素知识介绍 作者： 来源： 发布时间： 2009-12-04 11:19 浏览次数： 478 细菌与细菌内毒素的概念 细菌内毒素，英文称作Enolotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A 细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研
41、究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。 细菌英文叫Bacteria：为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌分为G+菌和G-菌两大类。这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见下表： 细胞壁结构 革蓝氏阳性菌 革蓝氏阴性菌 厚度 厚，15—50 薄，10—1
42、5 肽聚糖含量 多，占胞壁干重50—80% 少，占胞壁干重10%左右 脂类含量 少，约1—4% 多，约11—22% 磷壁酸 有 无 外膜 无 有 脂蛋白 无 有 脂多糖 无 有 关于细菌细胞壁结构，尤其G+/G-菌不同之处见下图所示： 由以上结构模式图可以发现，G+菌与G- 菌有不同之处，其中对于G- 菌来说： 细胞壁较薄，厚约10－15nm，结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。 （1）
43、脂蛋白（lipoprotein） 由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸 残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。 （2）外膜（outer membrane） 是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。（3）脂多糖（lipopolysaccharide
44、LPS） 由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成（图1-8），位于最外层。多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原（O抗原），有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。 细菌内毒素即：许多病原性细菌所产生的毒素。 一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；
45、它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。加一类为内毒素（Endotoxin）。是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。 细菌外毒素与内毒素性质的比较 外毒素（Exotoxin） 内毒素（Exotoxin） 几乎无发热性 很强的发热性 细菌的代谢产物 细菌外壁层上的特有结构细胞破裂后游离出来 毒性作用强 毒性作用比较弱 很强
46、的免疫原性，制成抗毒素能中和抗原毒素 抗原性弱 单纯蛋白质，易被分解破坏 核酸多糖的高分子聚合物，不易被分解破坏 对热不稳定，无透析性 耐热性，无透析性 福尔马林可使其转化为类毒素 福尔马林不能使毒性消失 对肿瘤细胞几乎无影响 破坏肿瘤细胞 白喉毒素，肉毒毒素，破伤风毒素厌氧菌毒素，溶血性链球菌毒素等 大肠菌，霍乱绿脓菌，沙门氏菌，赤痢菌等 （1）外毒素（exotoxin） 有些细菌在其生命活动过程中产生毒素能释放到周围环境中，称为外毒素。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。如痢疾杆菌、霍乱弧菌等
47、细菌外毒素有以下特点： ①毒性强，如纯化肉毒杆菌外毒素结晶1mg可杀死2,000万只小白鼠，对人的最小致死量约为10-4mg，破伤风毒素对小白鼠的致死量为10-6mg，白喉毒素对豚鼠的致死量为10-3mg。②对机体组织有选择性的毒性，如白喉杆菌外毒素主要抑制蛋白质合成，特别是影响肽链延长，引发心肌炎、肾上腺出血及神经麻痹等；破伤风外毒素主要毒害脊髓前角运动神经细胞，引起所属肌肉的痉挛强直。 ③具有抗原性，外毒素的化学成分为蛋白质，有抗原性，即以外毒素刺激机体可产生大量的抗毒素，抗毒素能中和外毒素使其无毒。外毒素用甲醛处理后，脱毒变成类毒素，但仍保持抗原性。 （2）内毒素（exo
48、toxin） 是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性。内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。 内毒素的致病作用无特异性，即各种革兰氏阴性菌对人类引起基本相同的反应。少量内毒素可引起机体发热反应；大量内毒素进入血液，可使血管透性改变，局部出血，颗粒性白细胞增多或减少和体重下降，严惩毒时能导致内毒素性休克。内毒素毒性比外毒素小得多。 内毒素是外源性致热原，它可能激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。 细菌内毒素化学结构及化学组份 到目前为
49、止，我们知道细菌内毒素作为G－菌细胞壁外表层结构的一部分脂多糖（lipopolysacch aride,LPS）主要是由多糖O抗原，核心多糖和类脂A(Lipid A)三部分组成。见图所示： 类脂A位于最多层。多糖抗原向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，具有特异性，核心多糖分为内核心及外核心，外核心由数种已糖，包括葡萄糖，半乳糖，乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖及特殊的KDO (3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖)。KDO以不耐酸的酮糖键与类脂A的氨基葡萄糖连接。所有G-菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖为单位。通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物。具有致热作用。是革
50、兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分 细菌内毒素生物活性 类脂A作为内毒素生物活性的主要部分。也是近年来研究报道最多的。由氨基葡萄糖，磷酸，10-18碳的长链脂肪酸组成，它与可溶性的O-特异性链及核心分离后。即有难溶于水的特性。游离后的类脂A。可自身凝聚成高分子的复合体，其分子量大小不等。同时它也含有疏水性的中心及亲水性的边沿。是一种双相分子，又是酸碱两性分子，因此类脂A的独特结构使细菌内毒素具有多种的生物活性。 细菌内毒素不同水平上的生物活性 A.机体水平 发热性 致死毒性 体重减少 Shwartzman反应 骨髓反应（bone m
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