1、生物工程系专业实验报告书
专业：生物技术及应用 班级：生物专08-1 指导老师：刘杰凤
姓名：吴诗平 学号：08113090116 成 绩：
奶粉中亚硝酸盐的测定
一、实验目的
1.掌握样品制备、提取的基本操作技能。
2.进一步熟练掌握分光光度计的结构和使用方法。
3.掌握比色法测定食品中亚硝酸盐的原理和方法。
二、仪器与试剂
1．仪器
①分光光度计；②比色管、移液管、容量瓶等常用玻璃仪器
2.试剂
①亚铁氰化钾溶液：称取106g亚铁氰化钾溶于水，并定容至1000ml。
②乙酸锌溶液：称取220g乙酸锌，加30ml冰醋酸，
2、溶于水并定容至1000ml。
③硼砂饱和溶液：称取5g硼砂溶于100 ml热水中，冷却后备用。
④0.4%对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100 ml 20%的盐酸中，避光保存。
⑤0.2%盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2g盐酸萘乙二胺,溶于100 ml水中，避光保存。
⑥亚硝酸钠标准溶液：精密称取0.1000g于硅胶干燥器中干燥24小时亚硝酸钠，加水溶解移入500 ml容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液每ml相当于200ug亚
硝酸钠。
⑦亚硝酸钠标准使用溶液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00 ml, 置于100 ml容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液每m
3、l相当于10ug亚硝酸钠。
三、实验原理
样品经沉淀分离蛋白质，除去脂肪后，在弱酸的条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸起重氮化反应，生成重氮化合物，再与盐酸萘乙二胺偶合，形成紫红色的的染料，其颜色的深浅与亚硝酸盐的含量成正比，可与标准比较定量。通过分光光度计比色测定，计
算出样品中亚硝酸盐的含量。反应如下：
三、实验步骤
1、样品处理
准确称取奶粉2.50克于50ml烧杯中，硼砂饱和溶液6.3ml，以70℃以上的热水100～150ml将样品搅拌均匀后，全部洗入250ml容量瓶中，放入沸水浴中加热15分钟，取出冷却后，边转动容量瓶边加入亚铁氰化钾溶液2.5ml，摇匀后，再加入乙
4、酸锌溶液2.5ml，以沉淀蛋白质。然后，加水至刻度，混匀，放置半小时后，弃去上层脂肪，清液用滤纸或脱脂棉过滤，弃去初滤液5～10ml，滤液备用。
2、测定
吸取上述滤液20ml于25ml带塞比色管中，同时吸取0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50ml 5ug/mL的亚硝酸钠标准溶液（相当于0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ug/25mL的亚硝酸钠）分别置于25ml比色管中。
在样品管及标准管中分别加入0.4%对氨基苯磺酸溶液1ml，混匀后静置3～5分钟，然后又在各管及标准管中分别加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液0.5ml，加水至刻度，摇匀，静置15分钟后，用2
5、cm的比色皿，以零管调节零点，于波长538nm处，测吸光度。并查出待测液的亚硝酸盐含量。
3、求出线性回归方程，并以回归方程绘制标准曲线，用回归方程求出奶粉中含亚硝酸盐的量，计算线性相关系数及相对误差。
（mg/kg ）
式中：X—样品中亚硝酸盐的含量，g/kg；
A—样品溶液中亚硝酸盐的含量，ug；
m—样品的质量，g。
—测定时吸取样品液的体积与样品定容体积之比。
计算结果保留两位有效数字。
四、实验结果与数据处理
管号
6、 0 1 2 3 4 5 样1 样2
10μg/mLNaNO2 0 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50
标准液/mL
相当于亚硝酸钠量 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 / /
/μg
样品提取液/mL / / / / / / 0.05 0.05
0.4%对氨基磺 1.
7、00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00苯酸溶液/mL
混匀3~5min
0.2%盐酸萘乙二胺 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50溶液/mL
加水至刻度,混匀静置15min
OD538nm 0 0.024 0.048 0.077 0.102 0.114 0.065 0.068
图 一 亚 硝
8、酸 钠含量 的 标 准 曲：
由于R2 = 0.99，所以此曲线可用于做亚硝酸钠的标准曲线
又：y = 20.81x - 0.016，将两次测得的结果取平均值代入式子中得：
y=20.81×（0.065+0.068）/2-0.016=1.369（微克），
即：A=1.369
由：=2735.73=2.74×103mg/kg
由此可知：此奶粉不能食用，因为此奶粉中的亚硝酸盐已经超标了。
五、注意事项
①实验前要对容量瓶进行检漏及清洁。
②要注意把握实验过程中的时间还有把握住试剂的用量。
③注意加入试管中样品的浓度不要太浓，反应后最后颜色最好处于标准液之间。
④实验后要注意搞好卫生。
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