SD大鼠乳胶灌注脑动脉可视化技术的改良.pdf

CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023SD大鼠乳胶灌注脑动脉可视化技术的改良孙建宇1，蔡康希1，邢帅1，夏岩2，付伟伟2*1.青岛大学基础医学院，山东青岛266071；2.青岛大学附属医院病理科，山东 青岛266000Modified latex perfusion technique for visualizing the cerebral vasculature in SD ratsSun Jianyu1,Cai Kangxi1,Xing Shuai1,Xia Yan2,Fu Weiwei2*1.School of Basic Medicine,Qingdao University,Qingdao 266071,China;2.Department of Pathology,TheAffiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao 266000,China【中图分类号】R322-34【文献标识码】A【DOI】10.13418/j.issn.1001-165x.2023.5.22【关键词】大鼠；血管可视化；乳胶灌注；技术改良；脑血管病【Key words】Rat;Vascular visualization;Latex perfusion;Modified technique;Cerebrovascular disease【收稿日期】2022-11-12【网络首发时间】2023-07-10【基金项目】山东省自然科学基金面上项目（ZR202103011010）【作者简介】孙建宇（1997-），男，内蒙古赤峰人，硕士研究生，主要研究方向：法医病理学，E-mail：【通讯作者】付伟伟，博士，副主任医师，E-mail：eer-脑血管病是临床常见的一类疾病，具有高发病率、高致残率、高复发率的特点，随着人口老龄化的加剧，造成的社会经济负担也在逐年加重1,2。近年来脑血管疾病的相关研究取得诸多进展，但由于患者间存在较大的个性差异，且有些可能造成侵入性损伤的研究无法在人体开展，深入探索脑血管病的病理生理学变化需要实施以动物模型为观察对象的实验研究3。啮齿类动物的颅内血管解剖结构和生理功能与人类较为接近，价格低廉，容易实现实验条件标准化，是脑血管疾病领域生物研究最常使用的动物种类4。经典的乳胶灌注技术可对模型动物的脑血管进行标记实现可视化，从而快速提供最直接的血管形态学和空间分布信息，对血管相关参数进行采集和分析，是目前应用较为广泛的技术手段5。本实验对传统乳胶灌注方法进行改进，并将改良前后的 2种技术进行比较分析，旨在提高脑血管可视化成功率并规范操作步骤，报道如下。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物选用 40 只 SPF 级健康雄性 78 周龄 SD 大鼠，体重 250280 g，购自北京维通利华技术有限公司（许可证号 SCXK(京)2012-0001），乳胶灌注前于北京中医药大学动物房（SPF 级）适应性喂养 1周，所有实验操作步骤严格遵守实验动物伦理和使用制度规范6,7。1.1.2主要实验试剂天然乳胶、红色水性色浆、0.01M PBS 缓冲液（pH7.27.4）、戊巴比妥、0.9%氯化钠注射液、肝素钠、多聚甲醛。1.1.3主要器械与设备手术器械（眼科剪、眼科镊、止血夹、止血钳、拉钩、持针器等）、自制拉钩、自制鼠板、一次性医用三通阀、8-0 灌胃针、10 mL 和 50 mL一 次 性 注 射 器、100 mL 烧 杯、外 科 无 菌 纱 布 块、BT100-2J 恒流灌注泵、SZX7 体视显微镜、2000 万像素显微镜摄像头。1.1.4乳胶-PBS-色浆混合液配制由于乳胶-色浆溶液暴露在空气中极易凝固（机械稳定性 650 s），故每次使用前需现配。先将配制好的 0.01mol/L PBS缓冲液与白色天然乳胶液混合（体积比为 1：3），随后向乳胶-PBS 混合液中加入红色水性色浆（乳胶-PBS 混合液与色浆的比例为 20：1）8。使用玻璃棒持续搅拌均匀。当混合液转变为均匀的红色后，用 6层纱布过滤3次，尽量清除混合液中的沉渣。1.2研究方法1.2.1实验分组根据 SAS 9.3 软件生成的随机数字表，将大鼠按 1：1随机分为改良乳胶灌注技术组和传统灌注组，每组20只。1.2.2改良乳胶灌注技术采用 Peterson 等人9所报道的类似灌注泵灌注方法。灌注开始前，以10 mL注射器抽取 78 mL 配制好的乳胶-PBS-色浆混合液并排尽其中空气。为尽可能避免灌注过程中有气泡进入管道，需提前使用三通管将灌胃针、装有乳胶的 10mL 注射器、恒流灌注泵连接为一体（图 1），并用 PBS缓冲液排尽管道和灌胃针中的空气。大鼠按 100 mg/kg 过量注射 2%戊巴比妥麻醉，角膜反射消失后仰卧置于鼠板上，用橡皮筋固定四肢及门齿。横向剪开腹腔以充分暴露横隔，向上提拉胸骨剑突，剪开横隔造成气胸后沿两侧剪断肋骨，以止血钳固定胸骨柄。充分暴露心和主动脉，用眼科镊将其与周围的肺叶、胸腺等组织分离（若主动脉弓被胸腺遮掩，可适当钝性分离），用眼科剪剪开心尖，迅速插入 8-0 灌胃针，针尖经左心室进入升主动脉腔后用止血钳固定针尖，动作需轻柔以免使主动脉破裂。剪开右心耳以开放静脉血通道，此时可见暗红色静脉血 技术方法 614中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期从右心破口处流出。使用恒流灌注泵按 10 r/min 的速度向主动脉中匀速灌入 0.9%氯化钠注射液（含 10g/mL肝素钠）200250 mL，待大鼠双耳、肠系膜动脉无残留血液，四肢末端、两肺变白，双眼虹膜透明无底色，右心耳流出清亮液体时停止灌注。转动三通管上的换向阀门，接通装有乳胶-PBS-色浆混合液的 10 mL 注射器和灌胃针，按 10 mL/min的速度缓慢推注10，每只动物灌注总量约 57 mL（2mL/100 g）11，注意观察大鼠外耳表面动脉、肠系膜动脉是否有红色乳胶混合物充盈，四肢、虹膜及口唇是否变为粉红色，若符合上述条件则提示灌注成功。将动物置于碎冰上约 20 min 以便乳胶能在血管中充分凝固，随后用铡刀断头。此时大脑组织未经固定，较为柔软，脑血管缺乏有效保护，取脑时一定要缓慢轻柔并小心剥离脑表面的硬脑膜，以免损伤血管影响后续观察。将取出的脑组织放入 4%多聚甲醛中固定48 h，成像时将其置于盛有 PBS 缓冲液的培养皿中，在体视显微镜下观察并拍摄记录。1.2.3传统乳胶灌注方法采用 Todo 等12报道的乳胶灌注技术，即大鼠在深度麻醉状态下开放胸腔，将注射器针头插入左心室并剪开右心耳，将注射器针头用止血钳固定后，先用50 mL注射器抽取含10 g/mL肝素的生理盐水手动快速推注置换血液，冲洗速度先快后慢，待右心耳流出清亮液体后，改用 10 mL 注射器灌注预先抽取的乳胶-PBS-色浆混合液，更换注射器时注意避免混入空气，待大鼠双耳、虹膜、鼻唇粘膜泛红时停止灌注，灌注试剂配制、灌注液体量及其余后续操作步骤均与A组相同。1.2.4观测脑动脉相关参数参考 Okyere 等人13的方法，以大脑中动脉远端分支、大脑中动脉-大脑前动脉软脑膜吻合支血管作为观察对象，并通过 Image J软件的计数工具和 ImageView 4.11 软件测量相应血管的数量、直径、长度、跨度、曲率1315。1.2.5尼氏染色尼氏染色为一种标记神经元胞体内尼氏小体的染色技术。简单步骤如下：将乳胶灌注后的脑组织经蔗糖溶液梯度脱水后，冰冻切片，厚度为 10 m。将切片用尼氏染色液（北京索莱宝科技有限公司，G1430）于50 孵育45 min，分化液分化。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。1.3数据统计分析方法统计分析采用 IBM SPSS Statistics 22.0 软件，计量资料采用均值标准差（MeanSD）表示，符合正态分布的数据组间比较采用独立样本 t 检验（方差齐时）或 t 检验（方差不齐时），不符合正态分布的资料采用 Mann-Whitney U 检验；计数资料以百分数表示，组间比较采用2检验，P0.05 认为差异具有统计学意义。2结果2.1两组大鼠灌注成功率、操作时间比较两组大鼠灌注成功率，操作时间详细数据见（表1），改进组的成功率优于传统组（P0.05），但改进组操作时间长于 B 组（P0.05）。图1改良乳胶灌注技术设备连接示意图1.灌注泵 2.橡胶管 3.三通管 4.灌注针 5.注射器Fig.1Diagram of equipment connection for modifiedlatex perfusion technology1,perfusion pump;2,rubber hose;3,three-way pipe;4,infusionneedle;5,syringe表1大鼠灌注成功率（%）、操作时间（xs）Tab.1Comparison of perfusion success rate(%)and operation time(MeanSD)比较项目 Item灌注情况,%（只）Condition of perfusion,%(number)操作时间（min）Operation time(min)成功 Success失败 Failure改良组（n=20）Modified group(n=20)90（18）10（2）38.568.71传统组（n=20）Traditional group(n=20)55（11）45（9）32.497.62检验值Test value2=6.144t=2.346P0.0310.024 615CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023图2SD大鼠脑动脉灌注模型图A：乳胶灌注成功模型 B、C：乳胶灌注失败模型黑色箭头指 ACA-MCA 软脑膜吻合支 黑色三角形指大脑中动脉远端分支 蓝色箭头指因气栓导致血管无法为乳胶所填充的管腔 黄色箭头指血管破裂溢出乳胶Fig.2Diagrammatic figures of cerebral artery perfusion in SD ratsA:Diagrammatic figure of successful latex perfusion;B,C:Diagrammatic figure of unsuccessful latex perfusion;Among them,theblack arrows indicated the ACA-MCA pia meningeal anastomosis branch;the black triangles indicated the distal branch of the middlecerebral artery;the blue arrows indicated the lumen where the blood vessels could not be filled with latex due to air embolism;theyellow arrow indicated a broken blood vessel spilling latex3讨论目前，血管可视化技术应用广泛，种类繁多，不同种类的技术有不同的应用条件，乳胶灌注作为一种经典、应用广泛的技术手段，其优点为经济实惠且简便易行，可以轻松区分血管，但存在可操作性差、稳定性差、尚未有报道验证乳胶灌注后可进行后续其他实验等缺点。针对这些缺点，本实验对现有的乳胶灌注方法进行了恒流且密闭环境的改良。表2大鼠灌注失败原因Tab.2Cause analysis of perfusion failure in twogroups of rats失败原因Cause of failure气栓阻塞（只）Gas embolism(number)血管破裂溢出（只）Overflow from artery(number)改进组Modified group20传统组Traditional group72表3大鼠脑动脉相关参数（xs）Tab.3Comparison of cerebral artery related parameters between thetwo groups(MeanSD)比较项目ItemMCA直径（m）MCA diameterACA-MCA数量（根）ACA-MCA numberACA-MCA直径（m）ACA-MCA diameterACA-MCA长度（m）ACA-MCA lengthACA-MCA跨度（m）ACA-MCA spanACA-MCA曲率 ACA-MCA curvatureA组（n=18）Group A103.6317.2811.811.5222.633.54652.17124.52548.9192.181.130.15B组（n=11）Group B108.1719.5210.891.4321.472.81673.0794.15571.7481.631.060.04检验值Test valuet=0.645t=1.616t=0.922t=0.512t=0.675Z=1.798P0.5240.1120.3650.6130.5060.0723.1乳胶浓度的改良本实验的乳胶浓度比例是由一系列浓度实验淘汰优选出来的，最终获得具有较好粘度及流动性乳胶染料。天然乳胶原液的浓度较高（干胶含量 60.2%），如直接使用乳胶原液不仅会使乳胶在血管内过早凝集，造成灌注阻力增大，增加灌注时的难度，而且可能导致乳胶在血管中分布不均甚至造成血管破裂（多为主动脉）乳胶外溢，使微小血管不能得到充分灌注，从而直接影响整体的灌注成像效果16。Hansan 等17对比两种墨水混合的乳胶稀释液和常规乳胶的脑血管灌注可视化效果，发现传统乳胶灌注组只能标记大血管，对微小血管灌注效果不佳，认为是由于乳胶粘度 616中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期过高所致，这与笔者预试验阶段遇到的问题相似。毕振宇等18采用不同粘度树脂溶液交替灌注的方法进行血管塑形，其结果与本实验结果类似，经切片验证（图 3），乳胶灌注也可灌注到脑组织的微血管内（810 m），Hansan等19使用稀释后的乳胶溶液也可灌注到微血管中，证明乳胶在微血管灌注方面可以达到与树脂材料相同的效果。本实验的乳胶与树脂溶液应用场景不同，可以在组织保留的前提下观察到组织与血管之间的关系，且在低温环境下未发现乳胶不凝固和产生气泡等现象，故本研究在完成改良方法和传统方法血管成像技术比较的基础上，增加了进行多种实验的可能性，以进一步观察断层截面中脑血管的形态及数量，且相关结果并不会受到乳胶填充的影响，符合动物实验的“三替”原则。Li等20曾使用DiI染料直接标记血管，此种方法在灌注过程中对时间及速度要求严格，无法通过体表指征判断是否灌注完全。本实验将稀释的乳胶成功灌入脑组织内，且细小动脉显示清楚，在之后的甲醛固定过程中亦未出现乳胶流失，而对于血管灌注的优势在于经济实惠且简便易行，后续在普通体视显微镜下即可观察灌注结果。3.2乳胶灌注技术改良经验3.2.1传统手动灌注手动灌注作为一种常规技术手段，省时、耗材少，但无法保证灌洗压力恒定，若灌洗速度过快，会导致组织水肿，破坏正常组织结构；若灌洗速度过慢，则会使血管中的血液凝集，后续乳胶无法完全灌注至细小动脉中，灌注效果将大打折扣（图 2B）。其气泡的不可控性也可能因局部阻塞而导致血管破裂，使乳胶外溢遮蔽视野（图 2C）。如表 2所示，在本实验灌注失败的脑组织中，传统手动灌注组共有 9 只，其中，出现因气栓导致的乳胶充盈缺损有 7 只（81.8%），这使得微小血管管腔不能得到填充而成像效果不佳；因血管破裂乳胶外溢导致观测视野遮蔽的情况有2只（18.2%）（表2）。3.2.2灌注泵灌注相比于手动灌注，使用灌注泵可以维持稳定的压力和流速，灌注泵连接三通管，可将装有乳胶染液的针管提前固定在三通管上，有效避免更换液体时气泡进入，避免因空气栓塞所导致的血管染色中断和血管爆裂（图 2C）。本实验中，灌注泵改进组灌注脑组织失败共有 2只，皆因气栓导致乳胶充盈缺损，未见因血管破裂乳胶外溢导致观测视野遮蔽的情况（表 2）。由此可见，由灌注泵改进的密闭恒流乳胶灌注法要优于传统手动灌注法。3.2.3灌注过程中的经验在灌洗过程中可以观察胃及肠系膜血管灌洗情况，若胃及肠系膜血管变为无色，则证明灌洗成功；夹闭胸主动脉，观察耳廓、鼻尖及眼睛的灌洗情况，若变为白色，即证明灌洗成功，灌洗时间约为 1015 min。在剪开胸腔暴露心和主动脉的过程中，需小心修剪锁骨下方胸壁，其内血管错综复杂，若剪断重要血管会影响灌注效果。分离心与胸骨间的系膜时亦需注意避免破坏下腔静脉周围结构，图3SD大鼠脑组织尼氏染色切片（标尺50 m）非乳胶灌注组脑组织切片和乳胶改进组、乳胶传统组乳胶灌注成功的脑组织切片代表图 黑色箭头为乳胶灌注褪色后的残留物Fig.3Nissls stained section of SD rat brain tissueThe brain tissue sections of the non-latex perfusion group,the latex modified group and the latex traditional group were represented by thesuccessful latex perfusion of the brain tissue sections.The black arrow indicated the residue after the fading of the latex perfusion.The scalebar was 50 m 617CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023导致下腔静脉破裂出血影响后续灌注。此外，灌注针插入主动脉不宜过深，针头位置在主动脉根部为最佳，避免灌注过程中误插入其他分支动脉，导致血管内血液无法完全排出，形成血栓，干扰实验结果。若在灌注乳胶的过程中灌注针误插入主动脉弓上的分支血管，则在灌注过程中会出现两侧脑组织灌注量不一致的现象。肠系膜及胸前壁血管会快速出现染料颜色，因此不可做为灌注成功的标志。大鼠双耳、虹膜及口唇粘膜泛红，方可认为脑组织已灌注完全，此时应立刻停止灌注。若外周组织颜色过深，会导致颅内乳胶灌注过多，甚至导致颅内血管破裂，蔓延至局部脑实质表面，遮盖表面血管，也会静脉染色过深，干扰颅内血管分支的辨认。3.3尼氏染色乳胶灌注技术主要用于血管成像，且灌注的鼠脑未用多聚甲醛进行内固定，对于乳胶灌注后脑组织是否可以继续用于切片及其后的病理、免疫组化、免疫荧光研究，既往鲜有文献报道。本实验初步验证此种灌注方法对脑实质本身并无损害，灌注后的脑组织可继续进行切片染色（图 3），如此可以在同一脑组织中进行多种实验，增加数据可信性，节约标本，符合动物实验的 3替原则。此外，本实验在进行尼氏染色时发现红色染料在乙醇脱水过程中脱色，不能完整保留血管真实样貌，如果想要呈现脑组织内部血管走形，需注意避免与乙醇接触。3.4技术应用前景脑血管解剖结构是脑血流动力学的关键因素，也是缺血性损伤后脑损伤严重程度的决定因素21。在不同疾病条件下，脑血管会发生相应的结构改变，可靠的颅内血管可视化技术对研究脑血管病的发病机制以及评估某一干预措施疗效等至关重要9,22。本研究利用改良的乳胶灌注技术对SD大鼠的脑血管实现标记和可视化，能够清晰、直观地展现颅内血管网络的走形规律及分布特点，增强大鼠脑血管病实验的精确度和可信度，并提高了操作的成功率和可行性，为进一步深入开展脑血管病的形态学研究准备了技术条件。【参考文献】1 Campbell BCV,Khatri P.StrokeJ.Lancet,2020,396(10244):129-142.DOI:10.1016/s0140-6736(20)31179-x.2 Hankey 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