白喉病原学检测.doc

白喉病原学检测方法
病原学操作细则
1 目的
从病人咽部假膜或鼻咽部采集标本分离病原体。
2 适用范围
本操作细则适用于白喉杆菌的分离。
3 职责
检测人员：负责按照本操作细则对白喉杆菌的培养。
复核人员：负责对白喉杆菌菌的培养操作是否规范及细菌生长状态进行复核。
科室负责人：负责对科室综合管理。
4 方法原理
白喉杆菌在适应的培养基能良好生长。
4.1 白喉杆菌的分离培养和鉴定
从病人咽部假膜或鼻咽部采集标本分离病原体。
4.2 标本的采集
4.2.1 病人
以无菌棉拭子或无菌棉拭子吸附新鲜配制的亚碲酸钾、甘油盐水保存液从疑似患者咽喉假膜边缘蘸取标本或同时采取鼻咽拭子，放入灭菌试管内同时送检。
4.2.2 带菌者或疑似病人
由于未见到明显的假膜，故应采集鼻咽部或扁桃体粘膜上的分泌物送检。
4.3 鼻咽拭子接种吕氏血清斜面或亚碲酸钾培养基等作细菌培养观察鉴定
4.3.1 菌型
革兰氏阳性细长杆菌呈棒状，排列不规则，常呈人字形、栅栏状。庞氏染色可见异染颗粒。
4.3.2 培养及生化特性
白喉杆菌在血平板上形成灰白色、圆形光滑菌落，有溶血环。在亚碲酸钾血平板上，菌落呈中心黑色或灰黑色，边缘带灰色。在尿素卵黄双糖培养基上，经37℃12～48h培养后可做初步鉴定。白喉杆菌发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖，产酸不产气，不发酵乳糖、甘露醇，一般不分解蔗糖。不产生吲哚，能还原硝酸盐，酶阳性，氧化酶阴性，不液化明胶，不分解尿素。重型白喉杆菌能分解淀粉、糖原和糊精，迟缓分解蔗糖。依据形态、培养、生化特性可将白喉杆菌分为轻、中、重三型。
4.2 毒力试验
白喉是由白喉杆菌引起的急性传染病，其致病因素为外毒素。抗原性强，毒性剧烈。白喉杆菌不是所有菌株都有毒力，只有那些携带β－棒状杆菌噬菌体的菌株才能产生外毒素。毒力试验可测定白喉杆菌产生外毒素的能力，常用的方法有两种。
4.2.1 艾立克(Elek)氏平板毒力试验
将Elek培养基加热熔化，冷却至50℃左右，加入正常无菌(兔或牛)血清2mL，混匀后用无菌镊子取预先制好的白喉抗毒素(每毫升含5000～10000u)，干燥滤纸条贴于平板中央表面，置37C孵箱内约0.5h，烘干表面水分，时间不宜过长，以免影响结果。
将试验菌株划线接种于平板上成一直线，使其与抗毒素滤纸成直角相交。同一平板可同时接种4～5个标本。同时要用已知有毒菌株作阳性对照。于37℃培养48～72h，如发育良好即可观察结果。阳性者于距纸条稍远处沿接种线开始有絮状沉淀弧出现。若干72h仍未出现沉淀弧者可作阴性报告。
4.2.2 豚鼠皮内接种毒力试验
将待试菌株接种吕氏血清斜面，于37℃培养16～18h，加肉汤1mL，刮下菌苔，使成悬液，吸取此菌液0.5mL，加入3.5mL肉汤中，混匀后即可应用。同时要用已知有毒菌株作对照。
选体重250g左右豚鼠两只，一只在试验前24h腹腔注射白喉抗毒素1000u，作为对照动物；另一只不注射抗毒素，作为试验动物。接种前先将动物腹部向上，固定在架上。以温水洗净腹部后剃毛。剃毛后再用无菌生理盐水擦洗一次待干，用1mL注射器吸取菌液，准确注射0.1mL于皮内，可同时接种6～8株菌。注射后4h，给试验动物注射抗毒素4000u，以免因毒株毒力太强而致死。
注射后经24、48、72h，各观察皮内反应一次。对照动物无论接种有毒或无毒菌株，均应无局部反应；试验动物在注射有毒株的部位于24h呈红肿，48h在红肿部位边缘有化脓性病变，72h可见硬块，出现灰黑色坏死斑，无毒的菌株则无病变。动物毒力试验也可应用家兔及小鸡作试验动物。
4.3 白喉毒素试验(锡克氏试验)
白喉毒素试验可用于测定机体对白喉的易感性及判断白喉预防接种后是否产生免疫力。
4.3.1 方法
在两前臂掌侧上1/3处，左臂皮内注射白喉毒索液0.1mL，右臂皮内注射对照液0.1mL。
4.3.2 反应的观察与判断
阴性反应：两臂注射处无任何反应为阴性反应。两臂注射处稍有红色硬块，颜色较浅，界线不清，红色消退快，不留痕迹，在24～36h最为显著，48～72h基本消退，为假阳性。阴性和假阳性反应表示对白喉有免疫力，但感染量大时仍可得病。
阳性反应：注射对照液处呈阳性反应或假阴性反应(48～72h基本消退)，而注射试验液处呈现红色团块，界线分明，直径达1cm以上，通常于注射后24～48h开始出现，72～96h最明显，7d以后逐渐消退，遗留一个褐色斑，数周至数月后可以退净。阳性反应表示对白喉无免疫力。
4.4 血清学诊断方法
4.4.1 间接血凝法测定白喉抗体
⑴ 原理
间接血凝法是利用红血球作为载体，并经过一定处理后，使蛋白质抗原吸附于红血球表面，此种血球称为致敏血球。然后用致敏血球来测定相应的微量抗体。当特异抗体存在时，发生抗原抗体结合，血球就出现凝集，为阳性反应。
⑵ 材料
A、白类致敏血球：敏感度均不能低于0.003906IU/ml
B、标准抗毒素：用前需进行56℃30分钟灭活，用于测定致敏血球效价
C、 96孔U型血凝板
D、25ul加样器及25ul的多孔移液器。
⑶ 待检血清处理
A、经56℃30min灭活。
B、醛化血球吸收。吸收方法：待检血清1份加50％醛化血球2份，放37℃ 1～2h，离心沉淀，吸取上清即为1∶2稀释的血清样品。
⑷ 待检血清滴定
先在血凝板中每孔加入0.5％兔血清生理盐水一滴(0.025mL)，再将待检血清用微量滴管滴入第一孔中(0.025mL)，使与0.5％兔血清生理盐水混合注意不要发生气泡，混匀血清后，每孔均取0.025mL，加入到第二孔中。混匀后自第二孔中吸出0.025mL到第三孔中，如此类推，最后一孔取出0.025mL弃掉。或用0.025mL的稀释棒自第2孔开始作系列稀释。用微量滴管吸取0.025mL0.5％致敏血球加到每个孔中，加时滴管勿碰到孔壁，以免沾有抗血清。然后摇匀，放37℃ 2h取出，放2～10℃冰箱内次日晨判读结果，以“＋＋”为凝集试验终点。每份待检血清可做三个稀释度抗血清加鞣酸血球的对照，稀释方法如前所述(即1∶2，1∶4，1∶8)，以排除血清中非特异凝集。
⑷ 结果计算
待检血清单位＝待检血清终点稀释度×标准血清终点稀释度所含单位数。例如标准白喉抗毒素(10 IU/mL)终点稀释度为1∶2048，含有0.004 8 IU/mL，而待检血清终点稀释度为1∶8，于是其单位为0.038 IU/mL。
⑹ 结果判定标准
A、凝集的红血球均匀地铺在孔底形成一薄层为“＋＋＋＋”；
B、凝集的红血球基本同a)，只是在此薄层的底部有一很弱红圈为“＋＋＋”；
C、凝集的红血球在孔底形成的薄层，同时中间可见一松散的红圈为“＋＋”；
D、凝集的红血球在孔底形成一圆圈，周围可见少量的红血球比对照圆圈稍大为“＋”；
E、血球在孔底形成紧密的圆圈成圆点为“－”。影响血凝试验的准确性与敏感度因素很多，如用具的清洁，材料的标准化，操作的细致等。
4.4 酶联免疫吸附试验检测白喉毒素抗体
4.4.1 原理
利用包被在固相载体上白喉类毒素捕捉待检血清中相应抗毒素抗体，再用酶标记的抗人IgG抗体去掉反应(抗原－抗体－酶标记抗抗体)，利用底物使酶显色而测知是否存在抗体。
4.4.2 材料
⑴ 抗原：精制白喉类毒素1110Lf/mL。
⑵ 结合物：羊抗人IgG酶标记抗体。
⑶ 载体：1cm×4cm聚苯乙烯塑料管平底带盖。
⑷ 底物：邻苯二胺。
⑸参考血清
多份间接血凝法阳性高效价血清混合为阳性参考血清，多份阴性血清混合为阴性参考血清。
⑹ 被检血清：白喉暴发流行区的病人和健康者。
⑺ 测定仪：721型分光光度计。
4.4.3 方法及步骤
⑴ 包被抗原量及被检血清最适稀释倍数的确定
用阳性及阴性参考血清与抗原作方阵式滴定，确定本试验包被抗原浓度为20μg/mL，被检血清最适起始稀释度为1∶40。
⑵ 参考血清标准曲线绘制
阳性及阴性参考血清均从1∶40开始至10240二倍法稀释，反应结果用721型分光光度计测光密度OD值，γ＝492nm。本试验取三次测定结果的均值，以血清稀释度为横坐标，相对应的OD值为纵坐标，画曲线；然后用相关回归法确定OD值与血清稀释倍数相对应的标准曲线。阳性血清最高OD值为0.6，最低为0.1。因阳性和阴性血清呈明显差别的界限OD值为0.3处，故确定OD值大于等于0.3为阳性，其所对应的血清稀释度为1∶2560，即为一个单位。每份被检血清稀释度为1∶40，效价从标准曲线查出。经测算，两系数的P值皆小于0.01。
⑶ 抗原包被
每管加已稀释好的抗原1.0mL，放4℃过夜，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液(P.B.S)－吐温20洗涤三次，两次之间静止3min。
⑷ 加被检血清1.0mL，置室温2h，再洗涤三次，方法同前。
⑸ 加结合物(1∶8000)1.0mL，室温2h，洗涤同前。
⑹ 加底物液(0.04％)1.0mL，室温下30min，加2mol/L硫酸0.015mL，如终止反应立即测OD值。

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