用MEGA构建进化树.doc

如何用MEGA构建进化树
MEGA3.1是一个关于序列分析以及比较统计的工具包，其中包括有距离建树法和MP建树法；可自动或手动进行序列比对，推断进化树，估算分子进化率，进行进化假设测验，还能联机的Web数据库检索。下载后可直接使用，主要包括几个方面的功能软件：i)DNA和蛋白质序列数据的分析软件。ii)序列数据转变成距离数据后，对距离数据分析的软件。 iii)对基因频率和连续的元素分析的软件。iv)把序列的每个碱基/氨基酸独立看待（碱基/氨基酸只有0和1的状态）时，对序列进行分析的软件。v)绘制和修改进化树的软件，进行网上blast搜索。
用MEGA构建进化树有以下步骤：
1. 16S rDNA测序和参考序列选取
从环境中分离到单克隆，去重复后扩增16S rDNA序列并测序，然后与数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi比对，找到相似度最高的几个序列，确定一下你分离的细菌大约属于哪个科哪个属，如果相似度达到百分之百那基本可以确定你分离得到的就是Blast到的那个，然后找一到两个同科的，再找一到两个同目的，再找一到两个同纲的细菌，把序列全部下下来，以FSATA形式整合在TXT文档中，如

>TS1
GCAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTCGGGATGCATGTTCCGGGGTGGAAAGGTTTTCCGGTGCAGGATGGGCC

>gi|117572706|gb|EF028124.1| Rhodococcus sp. Atl25 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
CGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGAT

>TS2
TGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACT

>gi|56383044|emb|AJ809498.1| Bacillus cereus partial 16S rRNA gene, strain TMW 2.383
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACYGCATGGTTC………………………….
………………………….

参考序列选择有几个原则：a，不选非培养(unclutured)微生物为参比；b，所选参考序列要正确，里面无错误碱基；c，在保证同属的前提下，优先选择16S rDNA全长测序或全基因组测序的种；d，每个种属选择一个参考序列，如果自己的序列中同一属的较多，可适当选择两个参考序列。

2. 序列比对
将整理好的序列导入clustalx1.83，如图

接着

程序自动运行，得出结果，自动输出 .aln 和 .dnd 为后缀的两个文件。

序列比对也可以直接用MEGA来做。

3. 打开程序MEGA，如下图所示：

4. MEGA3.1只能打开meg格式的文件，但是它可以把其他格式的多序列比对文件转换过来，用.aln格式（Clustal的输出文件）转换.meg文件。点File:Convert to MEGA Format，打开转换文件对话框，从目的文件夹中选中Clustal 对比分析后所产生的.aln文件，点击打开。

5. 转换好的meg文件，会弹出一个提示信息，点击ok。

查看meg序列文件最后是否正常，若存在clustal. *行，即可删除。点存盘保存meg文件，meg文件会和aln文件保存在同一个目录。

6. 关闭转换窗口，回到主窗口，现在点面板上的“Click me to activate a data file”打开刚才的meg文件。

如果为蛋白质序列，选择“protein sequence电击“OK”，得到以下图示，数据输入之后的样子，窗口下面有序列文件名和类型。

而在另外一个窗口内，出现以下数据文件点击选择和编辑数据分类图标， 可对所选择的序列进行编辑，完成后点击close即可。

序列编辑完成后，可进行保存，点击保存后出现以下界面，点击ok即可。

7. 构建进化树的算法主要分为两类：独立元素法（discrete character methods）和距离依靠法（distance methods）。所谓独立元素法是指进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的（例如：一个序列上可能包含很多的酶切位点，而每个酶切位点的存在与否是由几个碱基的状态决定的，也就是说一个序列碱基的状态决定着它的酶切位点状态，当多个序列进行进化树分析时，进化树的拓扑形状也就由这些碱基的状态决定了）。而距离依靠法是指进化树的拓扑形状由两两序列的进化距离决定的。进化树枝条的长度代表着进化距离。独立元素法包括最大简约性法（Maximum Parsimony methods）和最大可能性法（Maximum Likelihood methods）；距离依靠法包括除权配对法（UPGMAM）和邻位相连法（Neighbor-joining）。
（1） phylogeny→UPGMA

（2）用Bootstrap构建进化树，MEGA的主要功能就是做Bootstrap验证的进化树分析，Bootstrap验证是对进化树进行统计验证的一种方法，可以作为进化树可靠性的一个度量。各种算法虽然不同，但是操作方法基本一致。进化树的构建是一个统计学问题。我们所构建出来的进化树只是对真实的进化关系的评估或者模拟。如果我们采用了一个适当的方法，那么所构建的进化树就会接近真实的“进化树”。模拟的进化树需要一种数学方法来对其进行评估。不同的算法有不同的适用目标。一般来说，最大简约性法适用于符合以下条件的多序列：i 所要比较的序列的碱基差别小，ii 对于序列上的每一个碱基有近似相等的变异率，iii 没有过多的颠换/转换的倾向，iv 所检验的序列的碱基数目较多（大于几千个碱基）；用最大可能性法分析序列则不需以上的诸多条件，但是此种方法计算极其耗时。如果分析的序列较多，有可能要花上几天的时间才能计算完毕。

过程如下
① 参数的设置：phylogeny→bootstrap test of phylogeny→NJ

②系统进化树的测试方法，可以选择用Bootstrap，也可以选择不进行测试。重复次数(Replications)通常设定至少要大于100比较好，随机数种子可以自己随意设定，不会影响计算结果。一般选择500或1000。有许多Model供选择，默认为Kimura 2-parameter，不同的Model有不同的算法，具体请参考专业的生物信息学书籍。设定完成，点compute，开始计算。

② 结果输出：这个过程所耗时间和序列的数量和长短成正比，程序就会产生这么一个树，该窗口中有两个属性页，一个是原始树，一个是bootstrap验证过的一致树。树枝上的数字表示bootstrap验证中该树枝可信度的百分比。 结果如下：

8. 进化树的优化：
１）利用该软件可得到不同树型，如下图所示：

除此之外，还可以有多种树型，根据需要来选择。

２）显示建树的相关信息：点击图标i。

３）点击优化图标，可进行各项优化：
􀀹 Tree栏中，可以进行树型选择：rectangular tree/circle tree/radiation tree。每种树都可以进行长度，宽度或角度等的设定

􀀹 Branch：可对树枝上的信息进行修改。

􀀹 Lable：可对树枝的名字进行修改。

􀀹 Scale：标尺设置

􀀹 Cutoff：cut off for consensus tree。一般为50%。

9、进化树的分类优化
􀀹 Place root on branch：可以来回转换。

48633; Flip subtree：180度翻转分枝，名字翻转180度。
􀀹 Swab subtree：交换分枝，名字不翻转。
􀀹 Compress/expand subtree与Set divergent time：可以把同一分枝的基因压缩或扩展。
点击Compress/expand subtree后，在要压缩的分枝处点击，出现以下界面，在name/caption 中输入文件名（例如wwww），其他还有很多的选项，设置好了，点击OK。

所得到的结果，可以在压缩和扩展之间转换。

10. 调整进化树
根据所的进化树的效果，要进行调整，包括多余序列删除、不足序列添加、种属名称标注等等，还要根据投稿杂志要求在PHOTOSHOP中修改等。完成后的进化树应包含充足的信息。本人所做进化树完成图如下：