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常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制

一、 RNA病毒（蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒等）

包括病料的处理、RNA的提取、反转录、和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。

1、 病料的处理
取组织病料约2克，加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水，置研磨器（灭菌）中研磨或者用剪刀细心剪碎，置-20℃中反复冻融三次，即可用于检测。
2、 RNA的提取
1） 取上述冻融三次的病料约200微升置1.5毫升的离心管中，加入500-600微升TRIzol剧烈振摇30秒后，静置5分钟后，再次剧烈振摇30秒后，静置5分钟。
2） 在加入200微升的氯仿，上下颠倒混匀30s，静置5分钟，4℃ 12000g离心15 min。
离心完毕后，取上清约400-500微升（注意不要吸到中间层白色物质）置新的灭菌好的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒数次后（不可剧烈震动）静置10分钟，4℃ 12000g离心10 min.可见管底部有少量白色沉淀，倒掉异丙醇，加入1毫升75％的乙醇（DEPC水配制），振摇，将白色沉淀悬浮，4℃ 7500g离心5 min。弃去上清，干燥沉淀物（将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上，室温约5 min即可）加入20μLDEPC水溶解用于RT-PCR，或于-20℃保存备用。
两步法：
1、反转录
在10μL的反转录体系中加入： 上述步骤中提取的RNA7μL、5×Buffer 2μL、10 mM dNTP 0.25μL、Oligo (dT)18 0.5μL或者下游引物0.5μL；65℃10分钟，迅速放置-20摄氏度冰箱中2分钟，加入M-MLV 100U/μL 0.25μL（反转录酶） 37℃水浴1h,即可做为PCR扩增的模板，立即用于PCR扩增或置于- 20 ℃保存备用。
2、PCR扩增
设立阳性和阴性对照，阳性对照一般为病毒液，阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。

反应总体系为25μL
cDNA 2μL，（模板）
25mmol/L Mg2+ 1.5μL，
2.5mmol/L dNTPs 20μL，
10× Mg2+ free PCR Buffer 2.5μL，
20mmol/ L上下游引物各1μL，
Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL
无菌双蒸水补至25.0μL。

PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s，共进行36个循环；最后72℃延伸10min。（根据不同的病毒设定时间和温度）
一步法：采用的是TaKaRa 的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒
在25uL反应总体系：
<1> PrimeScript 1 Step Enzyme Mix , 1uL
<2> 2 × 1 Step Buffer ， 12.5uL
<3> RNase Free dH2O ,6.5ul
<4> 20mmol/ L上下游引物各1μL，
<5> 提取的RNA模板：3ul
反应条件：50℃反转录30min，94℃预变性2min，进行30个循环（94℃变性1min，56℃退火1min,72℃延伸1min）, 最后72℃延伸10min。扩增完的PCR产物放4℃保存。
3、 凝胶电泳
1%琼脂糖凝胶的配制
0.25琼脂糖+25毫升TAE+1.25微升Goidview放入锥形瓶中，置烤箱中约1分钟沸腾后，摇匀，放置室外，约20-30分钟后倒入板中，约30-45分钟凝固后即可使用。
点样：将凝胶放入电泳槽中，DL2000的DNA Marker3-5微升，其它样品5微升+0.5-1微升的londingbuffer混合后点样，开启电泳仪，电压80-150V。
4、 PCR 产物回收纯化
取20μL PCR产物与4μL 6×Loading Buffer混匀，1%琼脂糖凝胶（GoldView 0.5ug/ml）电泳。电泳结束后，在紫外灯下切出含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的电泳缓冲液，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的多余凝胶以减小凝胶体积，从而提高DNA的回收产率。之后按照胶回收试剂盒产品说明书回收目的片段，并取1μL回收产物点样观察回收效果。
纯化步骤如下：
(1) 称量胶块重量，计算胶块体积，按照1mg等于1μL计算胶块体积；
(2) 向胶块中加入3倍胶块体积的融化液DR-I Buffer；
(3) 均匀混合后65℃水浴10 min，其间摇晃3-5次使胶块完全溶化；
(4) 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer 0.5倍体积量的DR-II Buffer，均匀混合；
(5) 转移液体至Spin column中，12,000 rpm 离心1min，弃滤液（可将滤出液体回收再离心一次以提高DNA回收率）；
(6) 将500ul 的RinseA加入Spin column 中，12,000 rpm 离心30s，弃滤液；
(7) 将700 ul 的Rinse B加入Spin column 中，静置2－3 min，12,000 rpm 离心30s，弃滤液；
(8) 重复上一步操作；
(9) 10,000 rpm，离心1min，弃滤液；
(10) 将Spin column 安置于一灭菌的1.5ml Eppendorf管中，在滤膜中央处加入灭菌双蒸水或者试剂盒中的洗脱缓冲液20-30微升，室温静置1－2 min；
(11) 12,000 rpm 离心1min，收集滤出液体再离心洗脱一次，即得到纯化的PCR产物。
注：PCR纯化产物可直接用于测序，如用PCR回收产物直接测序时，回收第10步中不可用洗脱缓冲液，只可用双蒸水。

5、 DNA病毒（PCV2、伪狂犬病毒、细小病毒等）
包括病料处理、DNA的提取和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。
1、 病料处理同上
2、 DNA的提取
1） 取处理好的病料约1毫升置1.5毫升的离心管中，12000 rpm/min离心五分钟，取上清液（500-700μl）.缴入等体积的氯仿剧烈振摇静止5分钟，12000 rpm离心10分钟，
2） 去上清至新的离心管中，加入终浓度为分别为10% 的SDS（约50微升）和50μg/ml蛋白酶K（约10微升），55℃作用1.5h-2h（提前准备好水浴锅）。
3） 加入200uL Tris饱和酚，振荡混匀，4℃，12000 rpm/min离心15min；
4） 取上清液，于一个新的离心管中，加入Tris饱和酚和氯仿各200uL，充分混匀， 12000 rpm/min离心15min；
5） 取上清于一新的离心管中，加入200uL氯仿，充分混匀，12000 rpm/min离心15min；
6） 去上清于新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置20min, 12000 rpm/min离心15min，弃上清。(无水乙醇提前冰浴)
7） 加入70%的乙醇（提前放入冰箱）冲洗沉淀表面和管壁，弃乙醇，晾干。（若无沉淀可以离心7500 rpm/min离心5min；
8） 最后加入20μl 无菌ddH2O溶解，-20℃保存备用。
3、PCR扩增
设立阳性和阴性对照，阳性对照一般为病毒液，阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。

反应总体系为25μL
cDNA 2μL，（模板）
25mmol/L Mg2+ 1.5μL，
2.5mmol/L dNTPs 2.0μL，
10× Mg2+ free PCR Buffer 2.5μL，
20mmol/ L上下游引物各1μL，
Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL
无菌双蒸水补至25.0μL。

PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s，共进行36个循环；最后72℃延伸10min。（根据不同的病毒设定时间和温度）
3、 凝胶电泳同上
4、 PCR产物的纯化回收以及测序同上。

试剂配制
1、DEPC水的配制
向灭菌的玻璃瓶中加入超纯水，然后加入DEPC至终浓度为0.01%（V/V）过夜搅拌（放置摇床中），高压灭菌即可。
2、病料处理用PBS的配制
NaCl: 8.00g
KCl: 0.20g
Na2HPO4 1.42 g
KH2PO4 :0.27g
向烧杯中加入800毫升去离子水，充分搅拌，用浓盐酸调节PH至7.4，加入去离子水定容至1升，高压灭菌后即可使用。
1、 TAE电泳液
1)50×TAE贮存液：Tris242g，冰乙酸28.5 ml和Na2EDTA.2H2O 37.2混合，向烧杯中加入800毫升去离子水，充分搅拌，加入57.1毫升醋酸，充分搅拌，加入去离子水定容至1升，室温保存。
(2)1×TAE工作液：50×TAE贮存液20 ml，加纯水定容至1000 ml。
4、10%SDS：10gSDS置于100-200ml烧杯中，加入80ml的去离子水，68℃溶解，调PH7.2,早定容100ml.
5、dNTP Mixture、ExTaqDNA聚合酶、TRIZOL等试剂均购自Invitrogen公司; M-MLV购自Promega公司。DL2000的DNA Marker , 一步法的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒
购自TaKaRa公司。Tris饱和酚，购自Solarbio。
检测用的引物：
1.蓝耳：
上游：JN1 5 CGGTTTTGATGGGCGACA 3
下游：JN2 5 TGCAGGCGTGCGAGGTAA 3
退火温度：53-56℃
检测缺失毒株用
2.猪瘟
<1>检测疫苗毒用
上游：HCV1 5AAACGGAGGGACTAGCCGT 3
下游：HCV2　５GATTCAACTCCATGTGCCATG３
退火温度：56℃

<2>检测野毒
上游：　CSFV1　　5-ACCTAATCTTACACTATGCAATC-3
下游：　CSFV2　　5-CTGGACTAGTCCCATCAAAT-3
退火温度：51-54 ℃
3.传染性胃肠炎
上游： TGEV1 5-GATGGCGACCAGATAGAAGT-3
下游： TGEV2 5-GCAATAGGGTTGCTTGTACC-3
退火温度：51 ℃
4.流行性腹泻
上游：PEDV1 5- GAAATAACCAGGGTCGTGGA-3
下游：PEDV2 5-GCTCACGAACAGCCACATTA-3
退火温度：51 ℃
5.乙脑
上游：JE -1 5 AACAGCATGCAAATCGAAGAC3
下游：JE- 2 5 CCAGAAACATCACCAGAAGG3
退火温度：55 ℃

6.伪狂犬
上游：PRV-gB-F 5’CGTCGAAGTACACGTACCCG3’
下游：PRV-gB-R 5’CTCGAGCGAGCTGCAGAACAAG3'
退火温度：55 ℃
7.细小
上游：PPV-F 5’CCCAGAGGCAACAGCAATTAGG 3’
下游：PPV-R 5’CGAGATCTTGTGAAGATGTGG3’
退火温度55℃
8.圆环
上游：PCV2-F 5’CAACAGCATGCCCAGCAAGAAGAAT3’
下游：PCV2-R 5’TAGATTACACAGTCTCAGTAG3’

退火温度55℃