荸荠球茎膨大相关基因COL5的克隆及表达分析.pdf

热带作物学报 2023,44(10):19651973 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2022-10-20；修回日期 2022-12-19 基金项目 国家重点研发计划项目（No.2018YFD0901003）；国家自然科学基金项目（No.31801607）。作者简介 赵若男（1997），女，硕士研究生，研究方向：果蔬加工与保鲜。*通信作者（Corresponding author）：刘英健（LIU Yingjian），E-mail：。荸荠球茎膨大相关基因 COL5 的克隆及表达分析 赵若男1,2，玉万国2，陈振林1，宋慕波1,2，刘英健1*1.贺州学院食品科学与工程技术研究院，广西贺州 542899；2.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州 545616 摘 要：荸荠（Eleocharis dulcis）的膨大球茎是其主要的可食部位，而参与膨大过程调控的相关基因尚不清楚。COL5（CONSTANS-Like 5）基因是 COL 基因家族成员之一，可能在植物储存器官发育和膨大过程中发挥重要作用。为了研究荸荠 COL5 在球茎膨大过程中的表达模式及可能的作用，从荸荠转录组数据库中筛选与其它植物 COL 基因同源性较高的转录本片段并克隆其 cDNA 序列以及 DNA 全长，进而对其进行生物信息学分析和时空表达模式分析。结果表明：克隆得到的荸荠膨大相关 COL 基因 ORF 长度为 1017 bp，可编码 338 个氨基酸，DNA 序列长 1275 bp，包含 1 个长度为 257 bp 的 内 含 子，将 其 命 名 为 CwCOL5（ON934922）。生物 信息学分 析 显示，CwCOL5 蛋白分 子 式为C1592H2515N477O508S17，预测蛋白质相对分子量为 37 010.39 Da，理论等电点为 5.89，总平均亲水值（gravy）为0.462，不稳定系数为 45.63，属亲水性不稳定蛋白质，有 31 个磷酸位点，无跨膜结构，无信号肽，亚细胞预测分析显示其定位于细胞核。CwCOL5 含有 2 个 B-box Zinc finger 和 1 个高度保守 CCT 结构域。系统进化分析表明，CwCOL5 与莲藕（Nelumbo nucifera）、拟南芥（Arabidopsis）的 COL5 蛋白亲缘关系较近。荧光定量 PCR 结果显示，CwCOL5 在叶片与荸荠皮中有较高的表达量，在球茎膨大前期表达快速上升。荸荠 COL5 属于典型的锌指蛋白转录因子家族，推测该基因可能参与荸荠球茎膨大过程。本研究在荸荠球茎中克隆 COL5 基因并分析其表达模式，为植物球茎膨大的分子机制研究提供基础。关键词：荸荠；CwCOL5；克隆；表达分析 中图分类号：S645.3 文献标识码：A Cloning and Expression Analysis of Corm Enlargement Related Gene COL5 of Chinese Water-chestnut ZHAO Ruonan1,2,YU Wanguo2,CHEN Zhenlin1,SONG Mubo1,2,LIU Yingjian1*1.Institute of Food Science and Engineering Technology,Hezhou University,Hezhou,Guangxi 542899,China;2.College of Bio-logical and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou,Guangxi 545616,China Abstract:The enlarged corm of Chinese water chestnut(Eleocharis dulcis)is the main edible part,and the related genes involved in the regulation of the corm enlargement process remain unclear.COL5(CONSTANS-Like 5)gene is a member of COL gene family,which may play an important role in the development of plant storage organs.The transcript frag-ment with high homology to COL gene in other plants was screened from the Chinese water-chestnut transcriptome da-tabases and cloned its cDNA sequence and full-length DNA,and then the bioinformatics analysis and spatiotemporal expression pattern analysis were analyzed to study the expression pattern and possible role of Chinese water-chestnut COL5 during corm enlargement.The results showed that the cloned COL5 gene related to Chinese water-chestnut enlargement had an ORF of 1017 bp,encoding 338 amino acids,and the DNA sequence was 1275 bp,containing an intron of 257 bp,which was named CwCOL5(ON934922).Bioinformatics analysis showed that the CwCOL5 protein with the formula C1592H2515N477O508S17,the relative molecular weight of the predicted protein was 37 010.39 Da,and a theoretical isoelectric point of 5.89.The total average hydrophilic value(gravy)was-0.462,the instability coefficient 1966 热带作物学报 第 44 卷 was 45.63,which was a hydrophilic unstable protein.There were 31 phosphosites,no transmembrane structure,and no signal peptide,and additionally subcellular prediction analysis showed that it was located in the nucleus.CwCOL5 contained two B-box Zinc fingers and a highly conserved CCT domain.Phylogenetic analysis showed that CwCOL5 was closely related to the COL protein of Nelumbo nucifera and Arabidopsis.The results of PCR showed that CwCOL5 had a high expression in the leaves and water-chestnut peel,and the expression of CwCOL5 increased rapidly in the early stage of corm enlargement.The CwCOL5 gene belongs to a typical transcription factor family of zinc finger protein,and the gene may be involved in the process of corm enlargement of Chinese water-chestnut.In this study,COL5 gene was cloned from the corm of Chinese water-chestnut and its expression pattern was analyzed,which would provide a theoretical basis for molecular mechanism of plant corm enlargement.Keywords:Chinese water-chestnut;CwCOL5;cloning;expression analysis DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2023.10.004 荸荠（Eleocharis dulcis）也称马蹄，是禾本目莎草科荸荠属的一种浅水植物1。作为中国特色水生蔬菜，荸荠在广西、福建、海南等地均有大面积种植2。荸荠的球茎与莲藕的根茎、马铃薯的块茎、洋葱的鳞茎等都属于地下变态茎3。膨大的荸荠球茎可供食用，口感清脆、汁多味甜，富含碳水化合物、蛋白质、维生素等多种营养物质，具有很高的营养价值1,4。荸荠球茎的膨大过程是一个复杂的发育过程，需要经历 4 个阶段5。球茎膨大的第一个阶段是匍匐茎阶段，此阶段球茎顶端开始膨大，淀粉积累较少；之后是膨大初期，此时球茎开始生长，淀粉逐渐积累；接下来是膨大中期，球茎生长速度减缓；最后是膨大后期，此阶段球茎生长速度又加快，淀粉快速积累6-8。球茎的发育直接关系到荸荠的产量。因此，开展荸荠球茎膨大的分子机理研究对优化荸荠育种有重要意义。近期研究中发现 CONSTANS-Like（COL）基因家族成员可能在变态茎发育过程中起主要的调控作用。COL 属于锌指蛋白转录因子家族，已知其家族成员在植物生长发育过程中扮演重要角色9-10。COL 基因包含 23 个保守结构域，靠近 N 端有 1 个或者 2 个 B-box Zinc finger 结构域，另外一个是靠近 C 端的由约 43 个氨基酸组成的CCT 保守结构域5,11。目前，COL 基因家族已经在许多物种中相继报道。在拟南芥中发现了 17 个COL 基因家族成员12，在水稻（Oryza sativa）中至少有 16 个13，大麦（Hordeum vulgare）中有 9个13，烟草（Nicotiana tabacum）中有 15 个14，杜仲（Eucommia ulmoides）有 8 个 COL 基因9。以往研究发现，COL 基因家族不同成员的功能各不相同。在拟南芥中的一系列研究发现，AtCOL4通过脱落酸依赖性信号参与植物非生物胁迫反应，增强植物的耐受性15。过表达 AtCOL9 可以延迟拟南芥开花16。AtCOL3 是侧根发育和形成的正调控因子，另外在短日光条件下，抑制芽的伸长，促进分支芽的形成17。AtCOL7 在拟南芥分支形成和下胚轴的伸长中发挥重要作用18。烟草中有 3 个 COL 基因在低温环境中表现出较大的差异，NtCOL13b 在叶片中有较高的表达量，而NtCOL16c 和 NtCOL16d 刚好相反14。最近研究发现，COL 基因在植物贮藏器官发育中扮演着重要角色。莲藕 NnCOL5 基因参与根茎的膨大，尤其在根茎膨大中期（S3 时期）表达量最高，并且在马铃薯中过表达 NnCOL5 可明显促进块茎单薯重和淀粉显著升高19。通过反义基因技术证实马铃薯（Solanum tuberosum）中的 1 个 COL 家族成员在块茎膨大发育过程中起负调控作用20。虽然在部分植物变态茎的发育过程中证实了 COL 基因的重要作用，但荸荠球茎中仅对淀粉合成过程中关键酶编码基因进行了克隆21-24，膨大过程中COL 基因的作用尚未有相关研究。鉴于此，本研究从前期转录组数据中筛选并克隆荸荠球茎膨大相关 COL 基因，并对该基因序列进行生物信息学分析，同时利用荧光定量 PCR分析该基因在球茎膨大过程中以及在不同组织中的表达模式。为进一步研究 COL 家族基因在荸荠膨大这一过程的分子机制和基因功能研究提供理论参考。1 材料与方法 1.1 材料 供试材料选取广西地方品种桂林荸荠，采自广西贺州市八步区荸荠种植田，根据荸荠球茎不同发育时期（S1S4时期，球茎最宽处直径分别约为 10、20、35、50 mm）进行取样。同时采集球茎膨大后期的根、叶片、荸荠皮和荸荠肉样品。第 10 期 赵若男等：荸荠球茎膨大相关基因 COL5 的克隆及表达分析 1967 液氮速冻于-80 超低温冰箱备用。植物 RNA 提取试剂盒购自华越洋生物科技（北京）有限公司；植物基因组 DNA 提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒、载体 PMD18-T、DH5 大肠杆菌感受态均购自 TaKaRa 公司。1.2 方法 1.2.1 荸荠基因组 DNA、总 RNA 和 cDNA 的合成 从80 超低温冰箱中取出步骤 1.1 所储存的样品，按照植物基因组 DNA 提取试剂盒的使用说明书分别进行荸荠样品 DNA、总 RNA 的提取。用超微量紫外分光光度计检测总 RNA 的纯度和含量。对合格的 RNA 进行反转录从而获得cDNA 第一链，-20 储存。1.2.2 荸荠 COL5 基因的克隆 前期取荸荠叶、茎、根和球茎不同膨大时期的组织采用 Pacbio 平台进行全长转录组测序（Pacbio full-length cDNA sequencing），测序共获得 154 398 个转录本序列信息。在此荸荠转录组中筛选得到的 CwCOL5 基因序列信息设计引物（CwCOL5F：5ATGGG-AATAGAAAAAGGAGCCAAGT3，CwCOL5 R：5TCAAAATGTCGGCACCACACTGTAC3）。分别以荸荠球茎组织的 DNA、cDNA 为模板进行 PCR 扩增，具体反应体系及反应程序见表 1和表 2。通过 1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行 表 1 PCR 扩增反应体系 Tab.1 PCR amplification reaction system 试剂名称 Reagent name 用量 Dosage/L Premix Taq 酶 25 模板 cDNA 1 M13-F 1 M13-R 1 ddH2O 22 表 2 PCR 扩增反应程序 Tab.2 PCR amplification reaction procedure 步骤 Step 温度 Temperature/时间 Time/min 1 94 3 2 95 0.25 3 55 0.5 4 72 1.5 5 72 10 6 4 注：步骤 24，35 个循环。Note:Step 2 to 4,35 cycles.检测，切胶，使用 DNA 凝胶回收试剂盒进行纯化回收，将回收产物连接至 PMD18-T 载体后转入DN5 大肠杆菌感受态细胞中，经过菌液 PCR 后，挑选阳性克隆进行送测。1.2.3 荸荠 COL5 基因生物信息学分析 生物信息学分析参考董伟清等24和宋慕波等25的方法进行。利用 ORF finder、BLASTN、BLASTP、DNAMAN、ProtParam Tool、ExPaSy-SOPMA、SWISS-MODEL、SignalP 4.1 Server、Conserved Domains、TMHMM Server v.2.0 以及 NetPhos 2.0 Server 软件进行生物信息学分析；利用 ClustaW 1.83 和 Mega 5 软件构建系统进化树。1.2.4 荸荠 COL5 基因实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）分析 依据获得的 CwCOL5 基因序列设计荧光定量引物（CwCOL5-F:5ACGCTAAGT-CTGGCTATAGCTCTCT3，CwCOL5-R:(5AT GCATAGCGGATTGTCTTCTC3），该引物位于COL 家族序列保守度低的区域，以避免该家族其它成员的干扰。以荸荠不同膨大时期（S1S4时期）和不同组织（荸荠皮、荸荠根、荸荠肉和荸荠叶片）的 cDNA 为模板，以 18s rRNA（登录号：MG742686）为内参，进行 RT-qPCR 扩增。测定方法参考何芳练等22的方法进行，采用 2CT法计算相对表达量。1.3 数据处理 采用 Microsoft Office 2019 软件进行数据处理和分析，使用 Origin 2018 和 Adobe Photoshop 2021 软件进行图片处理及美化。2 结果与分析 2.1 荸荠 COL5 基因的克隆 在荸荠转录组数据库中筛选被注释为 COL家族成员的转录本片段，其中编号为 isoform_ 7928 的转录本预测蛋白与同为莎草科的蒿草（Carex littledalei）COL 家族成员同源性高达87%。在 NCBI 中的序列比对结果显示，该基因片段与其他物种的 COL 基因核苷酸序列同源性较高，其中与油棕（Elaeis guineensis）和生姜（Zingiber officinale）的核苷酸同源性分别为78.82%、77.97%。以该片段设计特异性引物，分别以荸荠球茎组织的 DNA、cDNA 为模板，通过PCR 扩增克隆分别得到长度约为 1000 bp 和1200 bp 的片段（图 1）。经回收测序结果表明，以 cDNA 为模板扩增得到的 cDNA 片段长为1968 热带作物学报 第 44 卷 1017 bp，编码 338 个氨基酸（图 2），将其命名为CwCOL5，登录号为 ON934922。以荸荠基因组DNA 为模板扩增得到的 DNA 片段长为 1275 bp，其含有 1 个长度为 257 bp 的内含子（图 3）。M:DL 2000 DNA marker;1：以 cDNA 为模板的扩增产物；2：以基因组 DNA 为模板的扩增产物。M:DL 2000 DNA marker;1:PCR amplification product of cDNA;2:PCR amplification product of genomic DNA.图 1 CwCOL5 基因 PCR 扩增产物电泳图 Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification products of CwCOL5 gene 图 2 CwCOL5 基因 ORF 序列及其编码的氨基酸序列 Fig.2 CwCOL5 gene ORF sequence and its encoded amino acid sequence 图 3 CwCOL5 基因结构图 Fig.3 Structure diagram of the CwCOL5 gene 2.2 CwCOL5 基因的生物信息学分析 2.2.1 CwCOL5 蛋 白 理 化 性 质 分 析 利 用ExPaSy-SOPMA 软件对 CwCOL5 氨基酸序列的理化性质进行预测。结果表明，CwCOL5 蛋白质由 338 个氨基酸组成，其中丙氨酸（Ala）和丝氨酸（Ser）占比最高，分别为 9.8%和 9.5%，其次是精氨酸（Arg），为 8.3%，不含吡咯赖氨酸（Pyl）、晒半胱氨酸（Sec）。分子式为 C1592H2515N477O508S17，总原子数 5109，理论等电点为 5.89，相对分子质量为 37 010.39，有 43 个带正电荷（Asp+Lys）的氨基酸残基，有 48 个带负电荷（Asp+Glu）的氨基酸残基。亲疏水性分析发现（图 4），CwCOL5蛋 白 质 第218 位 氨 基 酸 残 基 疏 水 性 最 强（Score=1.467），第 279 位氨基酸残基亲水性最强（Score=-3.789），总平均亲水值（GRAVY）为-0.462，不稳定系数为 45.63，推测为亲水性不稳定蛋白质。图 4 CwCOL5 蛋白氨基酸的亲/疏水性分析 Fig.4 Prohibicity/hydrophobicity analysis of amino acids for CwCOL5 protein 2.2.2 CwCOL5 蛋白质结构预测分析 利用Plant-mPLoc server 在线软件对 CwCOL5 蛋白质序列进行亚细胞定位分析，发现该蛋白定位于细胞核。对 CwCOL5 蛋白质进行磷酸化位点预测，结果发现，该蛋白有 31 个磷酸化位点，丝氨酸（Ser）23 个，苏氨酸（Thr）5 个，酪氨酸（Tyr）3 个，其中第 292 位丝氨酸预测得分最高，为0.996。利用 SignalP 4.1 Server 软件预测蛋白质信号肽，并利用 TMHMM Server v.2.0 软件预测蛋白质跨膜结构。结果显示，CwCOL5 编码的蛋白质无信号肽，且不含跨膜结构域。CwCOL5 蛋白质的二级结构显示，该蛋白具有 113 个（33.43%）-螺旋、13 个（3.85%）-折叠、178 个（52.66%）无规则卷曲和 34 个（10.06%）延伸链。使用 Swiss-Model 软件对第 10 期 赵若男等：荸荠球茎膨大相关基因 COL5 的克隆及表达分析 1969 CwCOL5 蛋白的三级结构进行同源建模，以系统自动匹配度最高的 7wsj.2.A 为参考建模时发现，其三级结构模型中无规则卷曲所占比例最高，与二级结构预测结果一致。2.2.3 CwCOL5保守结构域分析 将CwCOL5基因编码的蛋白氨基酸序列提交至 Pfam 网站在NCBI 进行蛋白结构域预测，结果发现（图 5），CwCOL5 编码的蛋白序列有 2 个高度保守的B-box Zinc finger 和 1 个 CCT 结构域。从结构域位置来分析，CCT 结构域位于 CwCOL5 蛋白的 C端，基序长为 43 个氨基酸，2 个 B-box Zinc finger位于 N 端且紧密相邻。2.2.4 多序列比对分析和系统进化树构建 使用GENEDOC 对 CwCOL5 蛋白质序列同在 NCBI 数据库中下载的 19 个其他植物 COL 蛋白质序列进行多序列比对分析（图 6）。结果中黑色部分表示蛋白序列同源性最高，其次是深灰色、浅灰色。荸荠 COL5 与其他植物同源蛋白氨基酸有较高的一致性，在 C 端和 N 端的序列都相对保守。采用MEGA 5.0 软件中的 Neighbor-Joining 法构建CwCOL5 氨基酸序列与拟南芥、烟草、番茄（Solanum lycopersicum）、高粱（Sorghum bi-color）、小米（Setaria italica）、大麦等 19 个物种COL 氨基酸序列的系统进化树（图 7），结果发现，依据拟南芥 COL 蛋白可以分为 2 个不同的分支，其中荸荠 CwCOL5 蛋白与 ATCOL5 等物种 COL 图 5 CwCOL5 蛋白结构域预测 Fig.5 CwCOL5 protein domain prediction 图 6 CwCOL5 氨基酸序列比对 Fig.6 CwCOL5 amino acid sequence alignment 1970 热带作物学报 第 44 卷 图 7 CwCOL5 蛋白系统发育进化树 Fig.7 CwCOL5 protein phylogenetic evolutionary tree 蛋白亲缘关系较近。2.3 CwCOL5 基因在球茎膨大过程中的表达分析 为了解 CwCOL5 基因在荸荠球茎膨大 4 个时期的表达情况，根据序列结果设计引物进行RT-qPCR 检测，结果显示，CwCOL5 基因 S4时期的表达量显著低于 S1、S2、S3时期（P0.05），S3时期的表达量最高（图 8）。不同小写字母表示差异显著（P0.05）。Different lowercase letters indicate significant difference(P0.05).图 8 CwCOL5 基因在荸荠球茎膨大过程中的表达分析 Fig.8 Expression analysis of CwCOL5 gene during corm enlargement in Chinese water-chestnut 2.4 荸荠 CwCOL5 基因组织表达模式分析 由图 9 可知，CwCOL5 基因在荸荠肉、根、叶片和荸荠皮中均有并表达，其中，在叶片和荸荠皮中的表达非常显著且表达水平相当（P 0.05），在荸荠肉和根部位表达水平相当。不同小写字母表示差异显著（P0.05）。Different lowercase letters indicate significant difference(P0.05).图 9 CwCOL5 基因在荸荠不同组织中的表达 Fig.9 Expression of CwCOL5 gene in different tissues of Chinese water-chestnut 3 讨论 荸荠在我国长江流域以及广西、广东等南方第 10 期 赵若男等：荸荠球茎膨大相关基因 COL5 的克隆及表达分析 1971 各省（区）都有大面积种植，被广泛用于食品、医药等领域，具有较高的营养价值、生态价值和经济价值1,4。研究发现 COL（CONSTANS-Like）基因是植物储存器官发育的重要调控基因26-27。然而，荸荠球茎作为一种典型的贮藏器官和变态茎，其球茎膨大调控机制的相关研究较少。本研究 克 隆 得 到 可 能 参 与 荸 荠 球 茎 膨 大 调 控 的CwCOL5 基因，该序列 ORF 长度为 1017 bp，可编码 338 个氨基酸，其 DNA 序列长 1275 bp，包含 1 个内含子。CwCOL5 基因结构特征以及长度均与莲藕 COL5 和马铃薯 COL 相似20,28。目前研究认为 CO-FT通路在植物变态茎发育的调控中起重要作用，而在该通路中 COL 基因家族扮演重要角色29-30。在拟南芥中，COL 基因家族蛋白根据其结构可分为 3 组，第 I 组包含 2 个B-box 结构域和 1 个 CCT 结构域；第 II 组只包含1 个 B-box 域和 1 个 CCT 域；而第 III 组包含 1个 B-box 结构域、1 个次级锌指蛋白结构域和 1个 CCT 结构域13,19,25。CwCOL5 与拟南芥 COL基因家族第 I 组的结构相同。马铃薯 COL 蛋白包含 2 个 B-box 结构域和 1 个 CCT 结构域，也属于第 I 组20。COL 蛋白在许多植物中参与光信号的感受与转导进而影响植物开花，例如过表达AtCOL5 时，FT、SOC1 相关开花基因表达上调，从而导致拟南芥可以在短时间内开花31。然而，有研究表明 COL 在马铃薯和莲藕中参与了马铃薯块茎膨大以及淀粉含量积累的调控19。因此，本课题组推测与 AtCOL5 和 NnCOL5 近缘的CwCOL5 可能参与荸荠球茎的发育调控。CwCOL5 在荸荠不同组织和球茎不同发育阶段均有明显表达，CwCOL5 在荸荠叶片和荸荠皮中表达量较高，在荸荠果肉中的表达量相对较低。马铃薯 COL 基因在叶片中的表达高于其他组织32，水稻、大豆、杨树中的 COL 基因作用的主要部位也是在叶片30,33-34，本研究发现CwCOL5 的表达模式与上述结果大体一致。在球茎发育过程中 CwCOL5 在球茎膨大前期表达量快速上升，而在膨大后期显著下调，这一表达模式与马铃薯 StCOL、莲藕 NnCOL5 相似19,31。基于上述结果，推测 CwCOL5 可能参与了荸荠球茎膨大过程，但球茎膨大过程存在复杂的调控机制，CwCOL5 与 CO-FT 途径其它关键基因如 FKF1、CDF1 和 SP6A 等的相互影响有待进一步研究。参考文献 1 江文,李杨瑞,杨丽涛,陈丽娟,蒙平.荸荠球茎主要性状观察及营养品质分析J.中国蔬菜,2009(2):51-54.JIANG W,LI Y R,YANG L T,CHEN L J,MENG 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