分子实验室手册.pptx

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Logo,*,Click to edit Master title style,Logo,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,第三篇,试验部分,第,7,章 配制试剂和缓冲液,第,8,章 贮藏和处理,第,9,章 无菌操作技术,分子实验室手册,第1页,第七章,配制试剂和缓冲液,分子实验室手册,第2页,Logo,确定所需之物,配制试剂与缓冲液,1,计算所需之物,2,稀释贮备缓冲液,3,称量和混合,4,测定,pH,值,5,缓冲液和溶液储存,溶液灭菌,6,7,分子实验室手册,第3页,一、确定所需之物,1.,熟读整个试验程序,写下所需要用到试剂。,2.,确定每一个试剂你要配制多少。,3.,确定配制直接使用溶液还是配制高浓度,贮备液。,4.,确认需要化学试剂能够在试验室里找到。,5.,假如没有库存应尽快取得药品。,分子实验室手册,第4页,安全性,1.,清楚你所接触每一个药品组分及相关毒,性,2.,遵照提议处理,（手套 眼睛保护 橱罩 面罩 标签）,3.,知道怎样使用通风橱,分子实验室手册,第5页,常见有害试剂,丙烯酰胺,神经毒性，用于蛋白质电泳凝胶和测序凝,胶制备，要戴面罩。,溴化乙锭,EtBr,是一个诱变剂，能嵌入,DNA,，用于核,酸标识。有毒，固体能够刺激皮肤和黏膜。,酚,强腐蚀性，能够灼伤皮肤，萃取和配制时应使用,通风橱。,苯甲基磺酰氟（,PMSF,）,分离蛋白质时用于对蛋白水,解酶抑制，吞咽或经过皮肤吸收都有可能致命,十二烷基硫酸钠（,SDS,）,去垢剂，易燃，尤其对于,鼻腔刺激性强，,SDS,质地光滑蓬松，称量时要动作,要轻盈和戴面罩。,分子实验室手册,第6页,水质分类,级别,特征,用途,自来水,常含有氯化物、碳酸盐、硫酸盐、泥沙及少许有机物等杂质,仅用于清洗玻璃器皿和其它试验设备,试验级用水,（三级水）,含有一些离子杂质,配置缓冲液,试剂级用水,（二级水）,含有微量无机、有机或胶态杂质,用于无机痕量分析等试验，如原子吸收光谱分析用水,超纯试剂级用水,（一级水）,基本上不含有溶解或胶态离子杂质及有机物,一级水用于有严格要求分析试验，包含对颗粒有要求试验，如高压液相色谱用，及细胞试验,分子实验室手册,第7页,塑料和玻璃器皿,用于混合玻璃器皿,烧杯 三角烧瓶 试管 容量瓶,不能用于混合玻璃器皿,量筒,储存缓冲液玻璃器皿,带线纹盖玻璃瓶 细胞培养液玻璃瓶 细口瓶,不适适用于缓冲液储存器皿,广口烧瓶 琥珀色容器 线纹盖子封口不严密,分子实验室手册,第8页,二、计算所需之物,1.,计算物质量浓度,2.,当量浓度（,N,）,1L,水溶液中溶解溶质用氢当量物除摩尔质量,3.,质量分数溶液,质量体积分数（,W/V,）,体积分数,(V/V),质量,/,质量分数,(W/W),分子实验室手册,第9页,三、稀释贮备缓冲液,连续稀释,稀释前,溶液,mg/ml,100ul,100ul,100ul,900ul,900ul,900ul,900ul,100ul,分子实验室手册,第10页,制备酚和酚氯仿,酚,无色透明，可直接用于分子克隆。,（注意：强腐蚀性，会灼伤皮肤，应带口罩、护目镜，穿防护衣，在通风橱内进行。,）,平衡酚,使用前，必须将酚平衡到,PH7.8,，因为,DNA,在酸性条件下会进入有机相。,酚：氯仿：异戊醇 （,25:24:1,）,含等量酚,-,氯仿,-,异戊醇混合物常在抽提核酸试验中使用，以除去蛋白质。氯仿能够使蛋白质变性，且有利于水相和有机相分离，异戊醇能够降低萃取过程中产生泡沫。,分子实验室手册,第11页,四,.,称量和混合,准备所需,称量纸,称量器皿,刮刀、药匙,洁净量筒,烧杯或三角烧瓶,磁力搅拌器和搅拌子,处置药匙和磁力搅拌子地方,擦拭纸,蒸馏水,分子实验室手册,第12页,称量,1.,称量时戴上手套。,2.,阅读瓶上标签。,（是否,戴面罩）,3.,打开天平电源。,4.,称量纸及称量器重量5.,称量材料。,（,能放回药品瓶中多出药品：该物质没有吸湿性；除了洁净称量纸及称量器，没有接触过其它物品。）,6.,药品倒入烧杯或三角烧瓶中。,7.,紧紧该上药品瓶盖。,8.,称量结束，清扫天平。,（不能马上加水药品，用铝箔或者塑料纸盖住烧杯口，做上标识，放到自己试验台上。）,分子实验室手册,第13页,混合,：,（对于多数溶液,）,1.,加入终体积约,80%,水到烧杯中，然后加固体溶质。,2.,轻轻放入磁力搅拌子，确保能有足够空间自由转动。,3.,先把烧杯放在磁力搅拌器上，打开低速搅拌开关，缓 慢调大转速。,4.,待溶质充分溶解后停顿搅拌。,5.,把溶解完全溶液倒入量筒或烧杯中，测定体积加溶剂使整个溶液体积靠近所需体积,90%,。,6.,将溶液倒回烧杯或三角瓶中，调,pH,值。,7.,在烧杯上标识好内容物。,分子实验室手册,第14页,五、测定,pH,值,校准,PH,计,最少两种,PH,标准溶液（通常使用,PH4,和,10,标准 液。）,34,个,50ml,玻璃或塑料药品杯,棉纸,分子实验室手册,第15页,校准,PH,计,1.,将电极从浸泡缓冲液中拿出，用蒸馏水冲洗，用棉纸巾小心擦干电极外面液体。,2.,倒出约,1.5,英寸,PH4,（或,10,）标准溶液，倒在小烧杯中，盖上瓶盖，把电极头浸入烧杯溶液中。,3.,按下,PH,计上“标准化”按钮，直到仪器上显示稳定,PH,为,44.,按下“待命”按钮，拿出电极清洗洁净并擦干。,5.,把,PH10,溶液倒入另外烧杯中，用一样方法标定。,6.,标定后清洗擦干，把电极插回保留液中保留。,7.,测定标准化缓冲液,PH,。,分子实验室手册,第16页,测定,PH,1.,在磁力搅拌器上搅拌准备调,PH,溶液。,2.,将电极从保留液中取出，用蒸馏水冲洗洁净，棉纸擦干，,PH,计状态应保持在“待命”。,3.,把电极头进入需测定溶液中，并确定搅拌子不会碰撞到电极。,4.,将,PH,计上转换开关从“待命”转到“,PH,测定”。,5.,读取数值，并用,NaOH,或,HCl,进行调整。,6.,将,PH,计功效调回到“待命”。,7.,将电极拿出，用蒸馏水冲洗洁净并用棉纸擦干。,8.,将电极浸入储存缓冲液。,9.,把调好,PH,溶液倒入量筒或容量瓶，定容。,10.,把定容溶液倒入有盖玻璃瓶或塑料瓶中密封。,11.,在瓶子上贴上标签，灭菌。,分子实验室手册,第17页,六、溶液灭菌,高压灭菌,大多数缓冲液，不明确细菌和酵母培养基。,不能高压灭菌,含有去垢剂缓冲液，如,10%SDS,，会因沸腾溢出。,有机溶剂，包含酚。,含有热不稳定成份，如血清、维生素、抗体、,BSA,等蛋白质。,哺乳动物、植物和昆虫培养基。,含,HEPES,溶液。,含有,DTT,二硫苏糖醇或,BME,溶液。,分子实验室手册,第18页,高压灭菌,1,.,将待灭菌器材、试剂放入高压蒸锅内，装液体瓶中液体不能超出,2/3,，盖紧盖子后松动一圈，或用铝箔纸包紧；,2.,高压灭菌开始时，先打开排气口，待热水蒸气排出数分钟后，关闭阀门灭菌，调温，,20,分钟。待压力降到,0,后放气；,3.,灭菌后，让瓶子冷却，并及时扭紧瓶盖；,4.,能够将高压蒸锅盖留一条缝，在加热至,100,度，冷却后高压蒸锅内器材也自动烘干了。,5.,普通器材开,15-20,分钟即可，液体,30,分钟。,分子实验室手册,第19页,高压灭菌,注意：,1,有时装液体瓶子可能破裂，可将瓶子放在钢制托盘中，预防瓶子一旦破裂时，试剂流入高压锅内。,2,高压灭菌全过程中，应有专员看护。,3,强酸、强碱、挥发性液体、爆炸性物质不能开蒸锅。,分子实验室手册,第20页,过滤除菌,用于热不稳定、易挥发或体积小于,20ml,溶液,。,利用重力、加压或真空方法，使溶液经过孔径足够小膜除去微生物。,0.2,微米滤膜,缓冲液和普通培养基,0.1,微米滤膜,组织培养培养基,分子实验室手册,第21页,七、缓冲液和溶液储存,培养液应该在,4,储存。,缓冲液能够在,4,或者室温储存。,浓度高溶液室温保留。,光敏感试剂应该在适宜温度下在棕色瓶中储存，或放在盒子里瓶内保留，瓶外裹上铝箔保留也能够。,分子实验室手册,第22页,第八章,贮藏和处理,分子实验室手册,第23页,Logo,紧急贮藏,1,储存试剂,2,分装,3,冰箱和冷库,4,试验室废物处理,5,贮藏和处理,分子实验室手册,第24页,紧急贮藏,物品,紧急贮藏方式,酸或碱,直接留在试验台上；单独保留酸和碱,单克隆和多克隆抗体,多数纯化过抗体长久在4保留，但有一些需要,-20保留,分析管,能够在4保留，但试验稳定性不一样（大多数比色反应不能过夜测定）,缓冲液,4,细胞,返回原处或丢弃,去垢剂,室温,DNA,4,分子实验室手册,第25页,紧急贮藏,物品,紧急贮藏方式,酶,大多数限制性内切酶保留在-20，但一定要先阅读说明，有些酶不能冷冻,乙醇,室温,生长因子和细胞因子,-20,PCR,反应,4,RNA,酒精中,-20,，水溶液,-70,脂类,-20，大多数脂类不稳定，对氧气或光线敏感，或者随温度改变而改变,培养基,4,分子实验室手册,第26页,紧急贮藏,细胞,平板或穿刺培养物,4,液体培养物,4,冻干培养物,4,冷冻培养物,-70,放射性同位素,32,P,核苷酸态，-20；磷酸盐，4,33,P,4,35,S,甲硫氨酸硫，-70,125,I,125I 蛋白质A，4；单质 125I 通风橱室温保留,3,H,4,14,C,4,分子实验室手册,第27页,储存试剂,储存试剂须知,储存和丢弃须知获取,怎样保留需要干贮试剂,怎样储存光敏感试剂,怎样储存氧敏感试剂,分子实验室手册,第28页,储存试剂须知,温度要求,把试剂储存在烘箱、室温、冰箱、低温冷柜或液氮中,空气要求,注意试剂是否对氧气敏感，或者需要其它气体保留,湿度要求,假如水蒸气对试剂有害，那么必须干贮或者真空保留,相关危害,：注意试剂是否是放射性同位素、易燃、剧毒或挥发性。试剂必须按照储存要求存放。,分子实验室手册,第29页,储存和丢弃须知获取,物质安全资料表（,MSDS,）,Merck,手册,环境健康与安全部门部,在因特网上搜索,分子实验室手册,第30页,怎样保留需要干贮试剂,容器,容器必须能盖紧，内部有放干燥剂空间。对于一些试剂，广口瓶是最好。对于更大瓶子来说，玻璃或塑料干燥器是必需。干燥器有不一样形状、大小和材料，应该首先考虑大小。性质活泼试剂需要真空保留，任何用于厌气培养细菌容器也需要真空润滑剂。,干燥剂,干燥剂通常是蓝色或紫色粗糙碳酸钙小圆球，或是相类似圆球。干燥剂普通装在袋子、桶或是有孔罐子里。干燥剂也能够用于气体干燥，但大多数试验室并不采取。,分子实验室手册,第31页,干燥器,PC-3,塑料真空干燥器,玻璃干燥器,分子实验室手册,第32页,怎样储存光敏感试剂,棕色瓶或琥珀色瓶储存，或者用铝箔包好。,管装试剂能够放在盒子中，可冻存或运输盒子最适合。将常规信息贴在盒子上，如“内有光敏感试剂”，不过光敏感试剂应是盒子中唯一试剂，不要在盒子中处处寻找其它试剂。,常见光敏感试剂有放线菌素,D,、丝裂菌素,C,、氮蓝四唑,(NBT),、酚、利福霉素和四环素。,分子实验室手册,第33页,怎样储存氧敏感试剂,氮气瓶必须放在化学通风橱附近，因为通常有机溶剂溶液需要氮气，使用时打开通风橱。,确定氮气瓶用带子固定住。,将巴氏管插入和压力调整器相连管子中。,打开氮气，将流量调整到将管子靠近手背也几乎感觉不到为止。,在通风橱中打开试管或瓶子，试管和瓶子应妥善放置在架子上。,将巴氏管尖端放入容器口至能看到液体表面有波浪，保持,5-10,秒，较高液体,-,气体百分比需更长时间。,快速盖上容器。,关掉氮气。,保留瓶子，通常保留在,-20,，也能够保留在真空。,分子实验室手册,第34页,分装,为何要分装,什么时候不用分装,怎样分装,分子实验室手册,第35页,为何要分装,预防储存液重复冻融造成降解,防止屡次使用造成污染,空间上方便,节约时间,分子实验室手册,第36页,什么时候不用分装,稀释物质不稳定,不惯用物质,使用不一样浓度或浓度改变范围较大物质,分子实验室手册,第37页,怎样分装,配制贮备液须知：,物质工作浓度,在什么溶剂中溶解物质,分装体积,决定配成几倍。,准备好无菌管子，做好标签。假如要分装物质必须冷藏，就把管子置于冰上。,配制浓溶液，假如需要，过滤。,把配好无菌溶液分装到试管,存放在冷藏库或者是适当温度架子上。,在统计本上做好统计。,分子实验室手册,第38页,冰箱和冷库,使用适当冰箱或冷藏库,只有在取试剂时候才打开冰箱门,冰箱或冷藏库内全部容器都必须有标签,定时清理那些已经不用试剂,把全部试剂放置位置统计下来,尊重私人空间,分子实验室手册,第39页,怎样除霜,除霜工作应该提前一个星期做计划,除霜前清理是丢弃无用试剂好时机,仔细地把全部试管包好,除霜要在早晨尽可能早时候开始,戴好手套除冰,备好任何能够吸水东西，还有放置丢弃吸水物盆,除霜,用吹风机加速除霜,除去全部产生水,保持地面干燥,把除过霜冰箱擦洁净,等到冰箱完全干了才能插上电源,统计试剂放置位置,分子实验室手册,第40页,试验室废物处理,试验室废物处理须知：,化学组成,有危害还是无危害,是否有放射性,是否有生物危害,是否能够回收利用,分子实验室手册,第41页,处理优先次序,放射性，固体；,放射性，液体；,化学危害废物；,生物危害废物；,尖利物品；,无害化学物品。,分子实验室手册,第42页,第九章,无菌技术操作,分子实验室手册,第43页,Logo,何时使用无菌技术,1,无菌技术,2,保护试验人员,3,无菌技术操作,分子实验室手册,第44页,什么时候使用无菌技术,当必须进行无菌操作时,不论什么时候在进行活有机体试验或是为进行活体试验二准备培养基、缓冲液、培养容器等时，必须使用无菌操作技术，比如：,准备转化用大肠杆菌培养物,制备,LB,平板培养基,分装细胞,过滤培养基血清,打开和溶解冻细胞,分子实验室手册,第45页,什么时候使用无菌技术,在无菌操作有帮助情况下,限制性酶切反应,：,即使大部分酶被保留在甘油中，而且甘油浓度大于,50%,时通常不会长菌，不过在稀释酶和进行没有甘油参加操作时存在潜在污染可能性，而且微量常见元素污染也会抑制酶活性。,进行,PCR,反应,：,进行,PCR,反应时要预防外源性,DNA,等污染，防止造成酶活性和特异性降低。,利用,32,P,磷酸盐标识细胞：,使用无菌技术是出于对本身保护，而不是出于保护细胞。出于无菌考虑，不应让盖子一直敞开，不能让气雾产生以及不要使用已经用过移液管。,分子实验室手册,第46页,无菌技术,规则,工作区域尽可能地远离通风口和交通口,确保整齐工作环境,试验前用消毒剂或清洁剂清洁工作区域,全部用到移液管和试剂瓶都必须是无菌,工作区间内尽可能降低手臂运动,把全部可能用到东西都准备好,戴好乳胶手套并及时更换,分子实验室手册,第47页,技术技巧,最小化,保持试剂瓶与桌面成大约,45,角时打开盖子,若必须取下盖子，则要把它倒放在洁净台面上,使用玻璃移液管及打开试剂瓶时都要用火烧一下,塑料试剂瓶和移液管不能用火烧,轻轻地吸收液体，不要旋转试剂瓶,不要让试剂瓶保持开口状态,停下你手中工作,分子实验室手册,第48页,移液,使用可重复使用玻璃移液管,使用一次性移液管,过滤除菌,用注射式过滤器过滤少许溶液,使用杯状滤器过滤大致积溶液,抽气操作,分子实验室手册,第49页,保护试验人员,生物安全水平要求,生物安全橱,生物安全橱是为操作原代培养物、菌毒株以及诊疗性标本等含有感染性试验材料时，用来保护操作者本人、试验室环境以及试验材料，使其防止暴露于上述操作过程中可能产生感染性气溶胶和溅出物而设计。更侧重于保护操作人员和环境，预防操作病原微生物扩散造成人员伤害和环境污染。,分子实验室手册,第50页,依据生物安全防护水平差异，生物安全橱可分为一级、二级和三级三种类型。,级别,试验员保护,试验物质保护,适适用于,部分保护,循环空气屏障，带HEPA,过滤器排气,没有,没有没有菌工作表面，房间内未过滤空气可进入工作区,低致癌病毒,超声处理等日常试验，及操作化学致癌物、易挥发物质等和通风橱类似，过滤效果极差,部分保护,空气循环屏障，带HEPA,过滤器排气,有全部流入空气都经过过滤,低、中致癌病毒,CDC13级试剂，全部需要BL2级保护物质。细胞和细菌培养物,全部保护,空间屏障（手套），带HEPA过滤器排气,有,全部流入空气都经过过滤，空气循环不如类，对原料保护也不如类,CDC4级试剂、全部需要BL4级保护物质。高毒性化学物质和致癌物。,分子实验室手册,第51页,生物安全橱,分子实验室手册,第52页,在生物防护橱中进行无菌操作,1.,确认通风橱已经打开而且空气正在循环。,2.,把框格降低到刻度处。,3.,不要妨碍空气流通。,4.,小心不要把碎纸和其它轻小物体吸入排气管道内。,5.,每次试验前用,70,乙醇或异丙醇等其它消毒剂擦拭桌面。,6.,试验中假如必须拿下盖子，把盖子倒放在洁净表面上。,7.,尽可能降低手臂在通风橱内晃来晃去。,8.,生物安全橱内不要使用火焰灯。,分子实验室手册,第53页,有礼貌地使用生物安全橱,恪守橱上张贴注意事项和提醒。,尽可能快使用通风橱。,自觉补充那些快用完公用试剂，如,70,乙醇等。,及时清理试验垃圾，不要让它们从垃圾箱中溢出来。,用完通风橱后清理内部。,分子实验室手册,第54页,致 谢,分子实验室手册,第55页,