肺炎克雷伯氏菌的药敏试验.doc

深圳动物园15株肺炎克雷伯氏菌耐药性的检测
动物医学院 动物医学 唐春成
（指导老师：杨光友 教 授）
摘要：目的：了解深圳动物园黑猩猩等10种灵长动物肺炎克雷伯氏菌的耐药特性及趋势，指导临床合理用药。方法：用K-B纸片扩散法做药物敏感试验。结果：检测的15株肺炎克雷伯氏菌对21种抗生素的药敏结果显示，对萘啶酸、氨苄西林、羧苄西林和四环素的耐药率最高，均为100%；其次为磺胺甲基异恶唑、头孢唑啉（先锋霉素V）、多西环素和多粘菌素B，其耐药率分别是93.33%、87.78%、80%和80%；对环丙沙星、阿奇霉素、诺氟沙星、头孢呋新、加替沙星、奈替米星和磷霉素的耐药率分别是73.3373.33%、60%、60%、53.33%、53.33%和53.33%；对头孢西林和呋喃妥因的耐药率均为40%；对头孢噻肟、亚胺硫霉素和阿米卡星的耐药率分别为33.33%、26.67%和20% ；菌株对拉氧头孢钠的耐药率为0 。结论：该地区肺炎克雷伯氏菌所引起的疾病治疗的首选药氧头孢烯类，其次可合理选用第三代头孢菌素、氨基糖甙类、碳青霉烯类、呋喃类药。
关键词：肺炎克雷伯氏菌；耐药性；检测
Resistance testing of 15 bahts Klebsiella Pneumoniae in Shenzhen zoo
Tang Chuncheng Veterinary，Grade2006
Directed by Yang Guangyou（professor）
Abstract：Objective: To understand the Shenzhen Zoo chimpanzees and other 9 primates Klebsiella pneumoniae‘s resistance characteristics and trends to guide clinical use of drugs. Method: K-B disk diffusion method to do drug susceptibility testing. Results: The detection of 15 bahts Klebsiella pneumoniae to 21 antibiotics showed that the resistance rate of Nalidixic acid, Ampicillin, Carbenicillin and Tetracycline are the highest are 100%；This was followed by SMZ-TMP, cefazolin (Vanguard ADM V), doxycycline, polymyxin B, that drug resistance rate was 93.33%,87.78%,80%,80%; to ciprofloxacin, azithromycin , norfloxacin, cefuroxime, gatifloxacin, netilmicin, fosfomycin the resistance rate was 73.33%,73.33%,60%,60%,53.33%,53.33% and 53.33%;Resistance rates of xilin of cephalosporins, nitrofurantoin were 40%; And resistance rates right cefotaxime, imipenem, amikacin were 33.33%, 26.67%, 20%; Fortunately,0 is the resistance rate of strain to Latamoxef sodium. Conclusion: The Klebsiella pneumoniae in diseases caused by treatment of first choice for drug oxacephems, followed by the selection of the third generation can be reasonably cephalosporins, aminoglycosides, carbapenems, furan, amide alcohols medicine.
Key words: Klebsiella pneumoniae; resistance; detect
肺炎克雷伯氏菌属于革兰氏阴性肠杆菌科(Enterobacteraceae)克雷伯菌属(klebsiella)。 本菌为兼性厌氧菌，无鞭毛，无动力。有较厚的荚膜,多数菌株有菌毛。营养要求不高，在普通培养基上生长的菌落大，呈粘液状，互融合，以接种环挑之易拉成丝，此特征有助于鉴别。37℃生长最佳，但能在15℃-45℃及pH5.5-10范围内生长发育，最适pH为7.0-7.6, pH在5以下和11以上不能生长，50℃以上既被灭活。本属具有O和K两种抗原。K抗原可用于菌型鉴定。O抗原耐热，1000℃2.5小时加热仍不能破坏其O不凝聚性。因而给本菌的O抗原鉴定和研究带来很多困难。克雷伯氏菌属现有82个英膜型，肺炎亚种大多属于3型和12型[1]。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pneumoniae)广泛分布于自然界，是人和动物肠道、呼吸道的条件致病菌[2]，于1893年由Friediander首先从患大叶性肺炎病人的肺组织中分离到，当机体免疫力降低或长期大量使用抗生素导致菌群失调时引起感染，可引起肺炎、败血症、脑膜炎、肝脓肿、眼内炎泌尿系统发炎，或是伤口感染等，若治疗不当则死亡率极高。在糖尿病患者合并肝脓肿的致病菌株分析中发现，在人类感染中目前是除大肠杆菌外的医源性感染最重要的条件致病菌。在动物中各种家畜家禽、野生动物及水生动物都可感染，其中野生动物主要包括金丝猴等灵长类动物。近年来由于β-内酰胺类药物广泛应用，革兰氏阴性杆菌对氨苄西林、头孢一代抗生素耐药率逐年上升，头孢唑啉抗菌活性优于氨苄西林，头抱唑啉平均耐药率为13.8％，而氨苄西林高达94.9％，不宜作为治疗肺炎克雷伯氏菌感染的首选用药，这是由于这些耐药菌株产生IM-1、TM-2、SHY-l等广谱β-内酰胺酶的缘故[3]。氨基糖苷类抗生素中阿米卡星抗菌活性优于庆大霉素及链霉紊。阿米卡星平均耐药率为13.4％。而庆大霉索、链霉素分别为26.2％、35.9％。临床菌株中对氨基糖苷类产生耐药性的主要机制为修饰酶产生，且3’-磷酸转移酶Ⅵ最多见[4]。磺胺类中复方新诺明平均耐药率达48．9％，不宜作为治疗肺炎克雷伯氏菌感染的首选用药[5]。临床菌株对磺胺类产生耐药性的主要机制是细菌能自身合成叶酸[6]。近年来的研究已证明，肺炎克雷伯氏菌的耐药性可由染色体介导或质粒介导产生，其耐药机制与下列3个方面有关：细菌外膜的屏障作用；作用靶位结构的改变；水解酶的产生[7-9]。
由于肺炎克雷伯氏菌能产超光谱β-内酰胺酶（ESBLs）[10]，以及抗生素的不合理使用导致耐药现象严重。为了了解深圳动物园肺炎克雷伯氏菌的耐药特性及趋势，指导临床合理用药。本实验将对该动物园黑猩猩等10种灵长动物消化道分泌物中分离出的肺炎克雷伯氏菌进行耐药性的研究，从而在灵长类动物临床上对该菌感染的用药有一定的指导意义，并可减少细菌耐药的产生。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株来源
自2009年4月从深圳动物园黑猩猩等10种灵长类动物呼吸道分泌物，由我校寄生虫病实验室分离培养鉴定并提供肺炎克雷伯氏菌15株，其编号分别为：SHE-1-1、SHE-2-1、SHE-2-2、SHE-5-1、SHE-6-1、SHE-7-1、SHE-10-1、SHE-10-2SHE-11-1、SHE-11-2、SHE-16-1、SHE-17-1、SHE-17-2、SHE-18-1、SHE-21-1。
1.1.2 抗生素纸片
本实验所用抗生素纸片均购自杭州微生物试剂有限公司。有如下21种：萘啶酸、诺氟沙星（氟哌酸）、环丙沙星（丙氟哌酸）、加替沙星、磺胺甲基异恶唑、头孢唑啉（先锋霉素V）、头孢呋新、头孢西林、头孢噻肟、羧苄西林、氨苄西林、阿米卡星、奈替米星、四环素、多西环素、磷霉素、呋喃妥因、拉氧头孢钠、亚胺硫霉素、多粘菌素B、阿奇霉素。
1.1.3 主要实验试剂
蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、柠檬酸钠、蒸馏水、pH试纸。
1.1.4 主要实验仪器
超净工作台、恒温干燥箱、恒温箱、超低温冰箱、电子天平、高压蒸汽灭菌锅。
1.2 实验时间与地点
本实验于2009年6月在四川农业大学国家级动物类实验教学中心进行。
1.3 实验方法与设计
1.3.1 培养基制做
由于该菌可以在普通琼脂培养基上很好的生长，故只需制做普通琼脂培养基。步骤如下：按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于2L烧杯中：牛肉膏：5g，蛋白胨:10g，氯化钠:5g，磷酸氢二钾:1g，蒸馏水:1000ml；将上述成分混合加热溶解后，以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整酸碱度至pH7.4-7.6；将pH测定后的肉汤培养基用滤纸滤过；将过滤好的肉汤分装试管，每管5ml，塞上棉塞，用包装纸扎好待灭菌；称取琼脂10g，加入500ml肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将pH调至7.4-7.6。再煮沸20分钟，并注意补充蒸发的水分，不断搅拌，不得使其溢出或烧焦；用蒸馏水湿润夹有薄层脱脂棉的纱布过滤后装入灭菌盐水瓶中，包扎好待灭菌；将待灭菌的培养基置高压蒸气锅内，121℃15-30min；将灭好菌的琼脂肉汤在合适温度（50-60℃）时倒入灭菌平皿中10-15ml/个，并使培养基平铺于皿底，即普通琼脂平板；将做好的培养基于冰箱内4℃保存。
1.3.2 K—B法药物敏感试验
将21种含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的浓度梯度，在纸片周围浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈(环)。操作步骤如下：将分离保存好的菌株在营养肉汤中培养，37℃恒温箱中培养10h左右，直到营养肉汤浑浊。与菌液比浊管比浊，调整浊度与比浊管相同；无菌环境中，将培养好的菌株接种于普通平板中。接种时，取其菌液0.2ml滴加于平板中，并用L型玻棒均匀涂布于平板中；待平板上的水分被琼脂完全吸收后，用无菌镊子取抗生素纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再移动。每个平板贴6张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平板边缘不少于15mm。在菌接种后15min内贴完纸片，置于37℃恒温箱中培养16-18h，观察并用精确度为1mm的直尺测定抑菌圈直径。判定标准：由于各种药物的抑菌圈大小的规定不同，根据所测抑菌圈大小来确定菌株对各种药物的敏感性。R为耐药，I为中敏，S为敏感（表1）。
表1 肺炎克雷伯氏菌耐药判定标准
Table 1 The standard of Klebsiella Pneumoniae resistance to determine
药物名称
抑菌圈直径（mm）
药物名称简写
药物含药量ug/片
R
I
S
萘啶酸
≤13
14-18
≥19
NAL

30
诺氟沙星（氟哌酸）
≤12
13-15
≥16
NFX
10
环丙沙星（丙氟哌酸）
≤15
16-20
≥21
CIP
5
加替沙星
≤14
15-17
≥18

5
磺胺甲基异恶唑
≤10
11-15
≥16
SMZ-TMP
300
头孢唑啉（先锋霉素V）
≤14
15-17
≥18
CZ
30
头孢呋新
≤14
15-17
≥18
CEF
30
头孢西林
≤14
15-17
≥18
CFX
30
头孢噻肟
≤14
15-22
≥23
CTX
30
羧苄西林
≤19
20-22
≥23

100
氨苄西林
≤13
14-16
≥17
AMP
10
阿米卡星
≤14
15-16
≥17
AMI
30
奈替米星
≤12
13-14
≥15
NTL
30
四环素
≤11
12-14
≥15
TE
30
多西环素
≤10
11-13
≥14
DOC
30
磷霉素
≤12
13-15
≥16
FOM
200
呋喃妥因
≤14
15-16
≥17
NFT
300
拉氧头孢钠
≤14
15-22
≥23

30
亚胺硫霉素
≤13
14-15
≥16
IPM
10
多粘菌素B
≤11

≥12

300IU
阿奇霉素
≤13
14-22
≥23

15
2 结果与分析
2.1 受检的15株肺炎克雷伯氏菌对21种抗生素的药敏结果显示：对萘啶酸、氨苄西林、羧苄西林、四环素的耐药率最高，均为100%：其次为磺胺甲基异恶唑、头孢唑啉（先锋霉素V）、多西环素、多粘菌素B，耐药率分别是93.33%、87.78%、80%、80%；对环丙沙星、阿奇霉素、诺氟沙星、头孢呋新、加替沙星、奈替米星、磷霉素的耐药率分别是73.33%、73.33%、60%、60%、53.33%、53.33%、53.33%；对头孢西林和呋喃妥因的耐药率均为40%；对头孢噻肟、亚胺硫霉素、阿米卡星的耐药率分别为33.33%、26.67%、20% ；菌株对拉氧头孢钠的耐药率为0（表2和图1）。
表2 15株菌株对21种抗生素的耐药率
Table 2 resistance rates of 15 strains to 21 antibiotics
抗菌药物
耐药
中介
敏感
萘啶酸
15（100%）
0
0
氨苄西林
15（100%）
0
0
羧苄西林
15（100%）
0
0
四环素
15（100%）
0
0
磺胺甲基异恶唑
14（93.33%）
1（6.67%）
0
头孢唑啉（先锋霉素V）
13（86.67
2（13.33%）
0
多西环素
12（80%）
2（13.33%）
1（6.67%）
多粘菌素B
12（80%）
0
3（20%）
环丙沙星
11（73.33%）
4（26.67%）
0
阿奇霉素
11（73.33%）
3（20%）
1（6.67%）
诺氟沙星
9（60%）
1（6.67%）
5（33.33%）
头孢呋新
9（60%）
3（20%）
3（20%）
加替沙星
8（53.33%）
3（20%）
4（26.67%）
奈替米星
8（53.33%）
3（20%）
4（26.67%）
磷霉素
8（53.33%）
4（26.67%）
3（20%）
头孢西林
6（40%）
2（13.33%）
7（46.67%）
呋喃妥因
6（40%）
5（33.33%）
4（26.67%）
头孢噻肟
5（33.33%）
8（53.33%）
2（13.33%）
亚胺硫霉素
4（26.67%）
3（20%）
8（53.33%）
阿米卡星
3（20%）
3（20%）
9（60%）
拉氧头孢钠
0
11（73.33%）
4（26.67%）
图1 15株菌株对21种抗生素的耐药率
Figure 1 resistance rates of 15 strains to 21 antibiotics
2.2 本实验数据还显示出本地区肺炎克雷伯氏菌出现了严重的多重耐药现象：SHE-1-1耐药14种、SHE-2-1耐药16种、SHE-2-2耐药14种、SHE-5-1耐药11种、SHE-6-1耐药14种、SHE-7-1耐药17种、SHE-10-1耐药16种、SHE-10-2耐药15种、SHE-11-1耐药12种、SHE-11-2耐药13种、SHE-16-1耐药12种、SHE-17-1耐药12种、SHE-17-2耐药10种、SHE-18-1耐药13种、SHE-21-1耐药11种（表3）。
表3 15株菌株的多重耐药情况
Table 2 Multi-drug resistance of 15 strains
菌株编号
耐药种数（种）
SHE-1-1
14
SHE-2-1
16
SHE-2-2
14
SHE-5-1
11
SHE-6-1
14
SHE-7-1
17
SHE-10-1
16
SHE-10-2
15
SHE-11-1
12
SHE-11-2
13
SHE-16-1
12
SHE-17-1
12
SHE-17-2
10
SHE-18-1
13
SHE-21-1

11
3 结论与讨论
本研究药敏结果显示本地区肺炎克雷伯氏菌对多种临床常用抗菌药物出现较高耐药率，且交叉耐药严重。本实验对肺炎克雷伯氏菌耐药机制进行了一定探讨。其耐药机制可能有下面几种：产生相应的灭活酶，灭活抗生素；改变靶位蛋白，降低靶蛋白与抗生素亲和力，或产生一种新的靶蛋白，使抗生素不能与其结合，不能发挥杀菌作用；改变细菌外膜通透性，减少抗生素进入菌体内或使其不能进入菌体，使抗生素无法发挥抗菌作用；增强外流(efflux)，通过菌体内流出泵系统(effluxpump system)将进入菌体内的抗生素泵出菌体外，使抗生素不能在菌体内积聚发挥作用[11]，主动外排机制是近年来研究较多的一个耐药机制，是细菌对抗生素耐药的另一个重要途径，在能量的支持下，外排泵系统可以将进入细胞的药物选择或非选择性地排出；当细菌内某种调节机制发生改变，导致外排系统表达亢进，使细菌体内的药物浓度降低而出现耐药；生物膜的形成[12]。此外一些细菌的耐药质粒可在细菌间相互传播。故加强肺炎克雷伯氏菌分离株的耐药监测，分析总结其耐药规律和特点，有助于指导临床合理应用抗菌药物。
3.1 肺炎克雷伯杆菌总体耐药情况
本实验检测了15株肺炎克雷伯氏菌，表2结果显示肺炎克雷伯氏菌对对萘啶酸、氨苄西林、羧苄西林、四环素的耐药率最高，均为100%：其次为磺胺甲基异恶唑、头孢唑啉（先锋霉素V）、多西环素、多粘菌素B，耐药率分别是93.33%、87.78%、80%、80%；对环丙沙星、阿奇霉素、诺氟沙星、头孢呋新、加替沙星、奈替米星、磷霉素的耐药率分别是73.33%、73.33%、60%、60%、53.33%、53.33%、53.33%；对头孢西林和呋喃妥因的耐药率均为40%；对头孢噻肟、亚胺硫霉素、阿米卡星的耐药率分别为33.33%、26.67%、20%。本实验结果提示肺炎克雷伯氏菌不仅对青霉素类、第一代头孢菌素、四环素、磺胺类等传统抗菌药物耐药，而且对近年来临床选用频率较高的氟喹诺酮类、第三代头孢菌素、酶抑制剂、氨基糖甙类、大环内酯类以及多肽类等也有较高的耐药性。这可能与本地区临床长期大量使用此类药物有关，因此应严格掌握抗生素应用指征，以减轻抗菌药物的选择性压力。对碳青霉烯类耐药率稍低，原因可能为碳青霉烯类药物具有独特的分子结构，而且该地区较少使用此类药物，细菌与其接触机会少有关。而对氧头孢烯还未产生耐药，分析其原因可能为：对细菌外膜有良好穿透作用；几乎对所有的β-内酰胺酶稳定；与靶位蛋白有较强的亲和力，特别是青霉素结合蛋白；临床应用少使细菌与其接触机会小，药物诱导耐药性的发生率低[13]。如今大多数细菌一对绝大部分抗菌药物产生了较高耐药性，需引起医学工作者的重视。尽早进行细菌的分离培养和药敏实验，指导临床合理用药，具有临床治疗和药物经济学的积极意义。
3.2 肺炎克雷伯菌氏多重耐药情况
本实验中可见一株细菌同时对多种抗生素耐药现象，原因可能有以下几点：细菌的质粒上常常携带着对多种抗菌药物耐药的基因，且这种耐药基因可在种或属间转移[14]；在这些细菌中一株细菌可同时产生几种ESBLs，同时产ESBLs细菌对抗菌药物作用靶位的改变及对抗生素通透性的改变，使产ESBLs细菌主动排出抗菌药物，且产ESBLs细菌缺乏自溶酶，而导致多重耐药[15]。对一些高危因素地区进行有目的监测，转移感染动物进行隔离等，均可有效控制耐药性产生及流行。
3.3 结论
对所试21种抗菌药物除拉氧头孢钠外，其它20种抗菌药物均有耐药菌株出现。经检测，本实验中15株菌对萘啶酸、氨苄西林、羧苄西林、四环素、磺胺甲基异恶唑的耐药率达到90％以上，对环丙沙星、阿奇霉素、诺氟沙星、头孢呋新、加替沙星、奈替米星、磷霉素、孢西林、呋喃妥因>40％，故本地区此类药物要慎用；应合理使用头孢噻肟、亚胺硫霉素、阿米卡星等耐药性稍低的药物；对氧头孢烯类药物耐药率最低，可将氧头孢烯类药物作为该菌菌引起的严重感染的首选药物。
参考文献：
[1] 贾艳，韩文瑜,杨洋,等.肺炎克雷伯氏菌致病机制研究进展.第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会论文集,2006
[2] 陆承平.兽医微生物学（第四版）[M].北京：中国农业出版社,2007：118-120
[3] 徐雪松，孙景春,李秀,等.肺炎克雷伯菌的耐药性与脉冲凝胶电泳分型[J].中华医学检验杂志，1999,22(1)：40-43
[4] 张军民，吴坚，阵民构，等.包氏不动杆菌5年耐药性监测结果分析[M].中华医学检验杂志，1999,22(1)：53-55
[5] 戴自英.临床抗菌药物学[M].北京：人民卫生出版杜,1985:86-87
[6] 尉挺,徐立傲．现代药物治疗学[M]．北京：人民军医出版社，1995:26-32
[7] Nkaido H, Vaara M. Molecular of bactorial outer membrence permeability.Micmbiolrer1985,49:1
[8] Jomesz A. Penicillin binding proteins end the antibacterial effectiveness of B一lectern entibidiea.Re, Intact Dis,1980:8-9
[9] Medeiroa AA, Geoge A .Jacoby beta lactarnase mediated resistance In B-Lactarn antibioticfor clinical use SF Gueeneral.New York,1986:49-50
[10] 倪语星.质粒介导的超广谱β-内酰胺酶的耐药性问题及检测[J].中华医学检测杂志,1999,22（5）：316-318
[11] 杨藻宸．药理学和药物治疗学（第一版）[M]．北京：人民卫生出版社，2000：1494-1543
[12] 杨帆，王红宁．细菌耐药机理及控制对策研究进展[J]．四川畜牧兽医科学，2003：30(1)：32-34
[13] 陈杖榴.兽医药理学(第二版)[M].北京：中国农业出版社，2007：197
[14] 黄瑞，秦爱兰，林发榕．耐药质粒在肠道杆菌间的接合传递研究[J]．苏州医学院学报， 1999，19(8)：1-5
[15] 刘恩芹.肺炎克雷伯氏菌产CTX-M型超广谱β内酰胺酶的检测及其耐药性分析研究.[学位论文].泸州，泸州医学院，2007
致谢：
又到收获的季节，也到别离的时刻，值此论文完成之际，衷心的感谢我的导师杨光友教授一直以来对我生活、工作、学习的亲切关怀，悉心指导和严格要求，他宽厚的人格、渊博的知识、精益求精的治学态度，丰富的阅历是我终生学习的榜样。同时感谢李波师兄在我试验过程中对我的指导和帮助。
在上大学的四年里，有幸得到许多老师和同学的帮助与鼓励。感谢班主任何敏老师对我的生活、工作、学习的关心、帮助和教导。感谢所有动物医学2006级7班的同学陪着我一路走过风风雨雨，给我的生活增添无数精彩的镜头。
特别感谢我的父母对我的默默支持与鼓励，因为有了他们的理解与支持，才让我安心学习。在今后的生活、工作过程中，我将能以更加实际的行动来予以报答。
值此毕业之际，谨以本文献给所有关心、支持和帮助过我的老师、同学和家人，衷心祝愿大家在未来的工作和生活道路上，一路走好!感谢四川农业大学的栽培，祝愿四川农业大学更加辉煌!
最后，向论文评审和答辩委员会的专家教授致以崇高的敬意和衷心的感谢!
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