α-L-鼠李糖苷酶水解朝藿定C制备淫羊藿苷工艺研究.pdf

鼠李糖苷酶水解朝藿定 制备淫羊藿苷工艺研究陈 旺，张 月，张宇航，冯自立，袁洪超（陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中；陕西理工大学，陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中；陕西金慧方中药科技有限公司，陕西 镇巴）收稿日期：基金项目：陕西省自然科学基础研究计划项目（）；陕西省重点研发计划项目（）；陕西省教育厅服务地方专项项目（）；秦巴生物资源与生态环境重点实验室（培育）“市校共建”科研专项（）作者简介：陈旺（），男，博士，副教授，从事天然产物结构改造与修饰研究。：，：通信作者：冯自立（），男，博士，教授，硕士生导师，从事天然药物有效成分制备工艺研究。：（），：摘要：目的 研究 鼠李糖苷酶水解朝藿定 制备淫羊藿苷工艺。方法 以缓冲液种类、值、温度、底物与酶用量比例、反应时间、底物质量浓度为影响因素，朝藿定 转化率、淫羊藿苷得率为评价指标，单因素试验优化制备工艺。再进行放大试验，柱色谱分离得到酶解产物，、对产物进行鉴定。结果最佳条件为磷酸盐缓冲液，值 ，温度 ，底物与酶用量比例 ，反应时间 ，底物质量浓度 ，朝藿定 转化率为 ，淫羊藿苷得率为 。在底物质量浓度 、反应体系 条件下，朝藿定 转化率均在 以上，淫羊藿苷产率均在 以上，而且几乎无副产物生成。结论该方法反应条件温和，底物质量浓度高，成本低，简便可靠，可为淫羊藿资源综合开发利用、淫羊藿苷绿色工业化生产提供基础。关键词：朝藿定；淫羊藿苷；鼠李糖苷酶；制备工艺中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，；，）：；淫羊藿苷为淫羊藿中的多羟基黄酮苷类活性成分，具有显著的抗骨质疏松、抗肿瘤、神经细胞保护、增强机体免疫力等药理作用，广泛应用于食品、保健品、化妆品、中成药等领域，但其对照品价格昂贵。朝藿定、淫羊藿苷母核相同，仅糖链有所差异，并且前者含量较高，对照品价格低廉，但它具有一定毒性，并且分离纯化过程复杂，导致资源浪费。目前，关于淫羊藿中黄酮苷类化合物的酶水解有大量报道，主要是蜗牛酶、纤维素酶、葡萄糖苷酶等脱去淫羊藿多糖苷 位的葡萄糖转化为低糖苷。文献 将淫羊藿混合黄酮与 菌液共孵育后得到淫羊藿苷，但其转化率低，分离纯化复杂。李丹凤采用酸对淫羊藿苷进行水解，虽然水解率较高，但反应难以控制，易产生副产物。以 鼠李糖苷酶将淫羊藿 转化为淫羊藿苷被认为是最特异、有效、环境友好的方法。、等在工程菌中克隆并表达了不同来源的 鼠李糖苷酶，发现纯化后的重组酶可将 年 月第 卷 第 期中 成 药 朝藿定 定向转化为淫羊藿苷。尹蔓妮报道通过 鼠李糖苷酶水解朝藿定 来制备淫羊藿苷的方法，但并未对工艺进行优化，并且底物质量浓度较低。因此，本实验优化 鼠李糖苷酶水解朝藿定 制备淫羊藿苷工艺，以期为淫羊藿资源综合开发利用及该成分绿色工业化生产提供参考依据。材料 试剂与药物 淫羊藿苷对照品（陕西乐博生化科技有限公司，批号，纯度）。朝藿定 （纯度，实验室自制）。鼠李糖苷酶（青岛隆川生物科技有限公司，批号）；牛血清白蛋白（陕西乐博生化科技有限公司）。乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。仪器高效液相色谱仪（型号 ，美国安捷伦科技公司）；核磁共振波谱仪（型号 ，德国布鲁克公司）；质谱仪（型号 ，美国 公司）；电热恒温水浴锅（型号，北京市永光明医疗仪器有限公司）；旋转蒸发仪型号，艾卡（广州）仪器设备有限公司；电子天平（型号，上海衡平仪器仪表厂）；电热鼓风干燥箱（型号，天津市泰斯特仪器有限公司）；数控超声波清洗器（型号，昆山市超声仪器有限公司）。方法 分 析 条 件 色 谱 柱（，）；流动相乙腈 磷酸（）；体积流量 ；柱温 ；检测波长 ；进样量 。对照品溶液制备精密称取朝藿定、淫羊藿苷对照品适量，甲醇溶解，制成分别含两者、的溶液，即得。方法学考察 线性关系考察分别取“”项下对照品溶液、，在“”项色谱条件下进样测定。以对照品进样量为横坐标（），峰面积纵坐标（）进行回归。精密度试验取“”项下对照品溶液，在“”项色谱条件下进样测定 次，计算朝藿定、淫羊藿苷峰面积。稳定性试验取供试品溶液 ，于、在“”项色谱条件下进样测定，计算朝藿定、淫羊藿苷含量。加样回收率试验取各成分含量己知（朝藿定 、淫羊藿苷 ）的淫羊藿约 ，共 份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入“”项下对照品溶液、甲醇各 ，精密称定质量，在 下超声（、）处理 ，冷却至室温，甲醇补足减失的质量，摇匀，上清液用 微孔滤膜过滤，取续滤液，在“”项色谱条件下进样测定，计算朝藿定、淫羊藿苷平均加样回收率、。单因素试验 缓冲液种类 取 朝藿定 对照品溶液 ，置于具塞试管中，加入 牛血清白蛋白溶液 ，磷酸盐（）、（）、醋酸醋酸铵（）、醋酸醋酸钠缓冲液（）各 ，鼠李糖苷酶 ，水浴反应 。值取 朝藿定 对照品溶液 ，置于具塞试管中，加入 牛血清白蛋白溶液 、磷酸盐缓冲液（、）、鼠李糖苷酶 ，水浴反应 。温度 取 朝藿定 对照品溶液，置于具塞试管中，加入 牛血清白蛋白溶液 、磷酸盐缓冲液（）、鼠李糖苷酶 ，分别在、下水浴反应 。底物与酶用量比例取 朝藿定 对照品溶液 ，置于具塞试管中，加入 牛血清白蛋白溶液 、磷酸盐缓冲液（）、鼠李糖苷酶，使底物与酶用量比例分别为 、，水浴反应 。反应时间 取 朝藿定 对照品溶液 ，置于具塞试管中，加入 牛血清白蛋白溶液 、磷酸盐缓冲液（）、鼠李糖苷酶 ，水浴分别反应、。底物质量浓度 按底物与酶用量比例 称取朝藿定、鼠李糖苷酶，加入牛血清白蛋白溶液、磷酸盐缓冲液（）适量，使朝藿定 含量分别为 、，水浴反应 。朝藿定 转化率、淫羊藿苷得率测定“”项下单因素试验结束后，加 甲醇终止 年 月第 卷 第 期中 成 药 反应，混合均匀，经 有机滤膜过滤，取续滤液，在“”项色谱条件下进样测定，计算朝藿定 转化率、淫羊藿苷得率，公式分别为转化率 （）、得率 （）（），其中 为朝藿定 初始量，为朝藿定 剩余量，为淫羊藿苷生成量，为朝藿定 相对分子质量，为淫羊藿苷相对分子质量。放大试验精密称取朝藿定 对照品，置于圆底烧瓶中，依次加入 牛血清白蛋白 、磷酸盐缓冲液（）、鼠李糖苷酶 ，水浴反应 ，取反应液 ，加 甲醇终止反应，混合均匀，测定反应液中朝藿定、淫羊藿苷含量，计算前者转化率、后者得率，其余反应液煮沸 后冷却，抽滤除去固体不溶物，水溶液采用 树脂浓缩后经制备色谱纯化，得到黄色固体化合物，经、确定结构。统计学分析 所有实验平行 次，相关数据采用 软件处理，以（）表示，通过 软件进行单因素方差分析。结果 方法学考察 线性关系考察中，朝藿定 回归方程为 （），在 范围内线性关系良好；淫羊藿苷回归方程为 （），在 范围内线性关系良好。精密度试验中，朝藿定、淫羊藿苷峰面积 分别为 、，表明仪器精密度良好。稳定性试验中，朝藿定、淫羊藿苷峰面积 分别为 、，表明溶液在 内稳定性良好。加样回收率试验中，朝藿定、淫羊藿苷平均加样回收率、分别为、；、。单因素试验 缓冲液种类 如图 所示，磷酸盐、醋酸醋酸钠缓冲液均具有较好的效果，但前者更稳定，故选择磷酸盐缓冲液作进一步考察。值 如图 所示，当 值为 时，朝藿定 转化率升高，淫羊藿苷得率接近；高于 时，朝藿定 转化率逐渐降低，但淫羊藿苷得率无明显变化，故选择 作进一步考察。温度如图 所示，当温度为 时，朝藿定 转化率升高，在 时达到最大图 缓冲液种类对酶水解反应的影响 图 值对酶水解反应的影响 值；后朝藿定 转化率降低，而温度对淫羊藿苷得率影响不大，故选择 作进一步考察。图 温度对酶水解反应的影响 底物与酶用量比例如图 所示，底物与酶用量比例为 时，淫羊藿苷得率趋于完全定向转化；高于 时，淫羊藿苷得率不断降低，生成副产物淫羊藿次苷，故选择 作进一步考察。年 月第 卷 第 期中 成 药 图 底物与酶用量比例对酶水解反应的影响 反应时间 如图 所示，当反应时间为 时，酶水解效率较快，在 时达 ；后酶水解效率升高程度缓慢，在 时朝藿定 转化率为 ，淫羊藿苷得率为 ；后开始出现副产物淫羊藿次苷，故选择 作进一步考察。图 反应时间对酶水解反应的影响 图 酶水解朝藿定 色谱图 底物质量浓度如图 所示，朝藿定 转化率、淫羊藿苷得率随着底物质量浓度增加均有所降低，为 时 两 者 分 别 为 、，但与低质量浓度（）相比无显著差异（）；随着其质量浓度进一步增加，朝藿定 转化率、淫羊藿苷得率继续降低（），同时反应体系中检测出副产物，故选择 作进一步考察。注：与 比较，。图 底物质量浓度对酶水解反应的影响 放大试验设定底物质量浓度为 ，总反应体系为 ，进行 批放大试验，结果见表。由此可知，朝藿定 水解率与小试结果基本相同，转化率均在 以上，而且朝藿定 几乎全部转化为淫羊藿苷，副产物生成较少，表明该工艺收率高，重复性好。表 放大试验结果（）（）试验号朝藿定 转化率 淫羊藿苷得率 平均值 结构鉴定（，）：（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）；（，）：（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（，），（），（，），（），（），（），（），（），（），（），（），年 月第 卷 第 期中 成 药 （），（），（），（），（），（），（），（），（）。：。以上数据与文献 报道基本一致，鉴定为淫羊藿苷。讨论与结论酸水解、微生物转化等方法易将朝藿定 中的糖基全部水解，反应不易控制，并且分离纯化难度大，不利于工业化应用，故本实验水解商品化的鼠李糖苷酶来制备淫羊藿苷，采用单因素试验考察缓冲液类型、值、温度、酶与底物用量比、反应时间、底物质量浓度等条件，并进行工艺放大，发现最优条件为温度 ，磷酸盐缓冲液，底物与酶用量比例 ；当底物质量浓度为 ，转化时间为 时，朝藿定 转化率为 ，淫羊藿苷得率为 。本实验所使用的 鼠李糖苷酶为国产商品化酶制剂，酶活力仅为 ，无法达到文献 中重组酶比活力和短时间内水解完全的效果，但其价格仅为文献 中所使用酶的，故延长反应时间可达到相对完全水解朝藿定 的目的，而且底物质量浓度达 ，高于文献 报道的 。放大试验结果显示，在底物质量浓度 、反应体系 条件下朝藿定 转化率均在 以上，淫羊藿苷产率均在 以上，并且几乎无副产物生成。综上所述，本实验利用 鼠李糖苷酶对朝藿定 的高选择性来进行不同品种淫羊藿的酶转化，通过酶水解获得高含量提取液，再以吸附柱色谱进行分离纯化，该工艺具有易于控制、底物质量浓度和转化率高、稳定性好、后续处理过程简便、成本低廉的优点，有望应用于相关工业化生产。参考文献：，：，：，（）：，（）：，（）：路宇仁，陈昳冰，崔元璐，等 淫羊藿苷药理作用研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：，：贾东升，贾晓斌，薛 璟，等 蜗牛酶转化淫羊藿苷制备淫羊藿苷 元的 研究 中 国 中 药 杂 志，（）：彭 静，马益华，陈 彦，等 固定化蜗牛酶同时生物转化淫羊藿 中 种 黄 酮 苷 中 成 药，（）：李瑞云，刘聪燕，许 婷，等 交联纳米 固定化蜗牛酶的制备表征及转化淫羊藿苷研究 中草药，（）：贾东升，贾晓斌，赵江丽，等 纤维素酶转化淫羊藿苷制备宝藿苷的研究 中草药，（）：徐凤娟，孙 娥，张振海，等 纤维素酶转化朝藿定 制备箭藿苷 的研究 中国中药杂志，（）：，（）：，（）：，：富盈昕，刘春莹，郭美娟，等 酶转化在淫羊藿苷提取中的应用 食品工业科技，（）：；李丹凤 淫羊藿黄酮水解产物化学成分的研究 大连：大连工业大学，：，（）：，：，：尹蔓妮 巫山淫羊藿成分分析以及成分转化研究重庆：重庆大学，（）：年 月第 卷 第 期中 成 药