建立SYBRGreen实时RT.doc

建立 SYBR Green 实时 RT

作者：温冬青，赵锦荣，孔亚林，郭慧芳，阎小君

【关键词】 聚合酶链反应

SYBR Green Ibased realtime quantitative RTPCR method for

detecting mRNA level of type I collagen in rats

【Abstract】AIM: To establish SYBR Green Ibased realtime

quantitative RTPCR method for detecting type I collagen mRNA in

rats. METHODS: Type I collagen cDNA was amplified by RTPCR method

and cloned into pMD18T vector. The recombinant plasmid was

selected and identified by sequence analysis. It was then

diluted pro rata as standard template. The mRNA expression of

type I collagen in rats was detected using realtime quantitative

RTPCR method with fluorescent DNA dye SYBR Green I. RESULTS: The

recombinant plasmid was established and confirmed as expected.

The kinetics graph after realtime PCR detected even one molecule.

The standard curve indicated the liner relationship between CT

(cycle threshold) and template concentration. The correlation

coefficient of external standard between the input copies and

fluorescence intensity was 0.991. CONCLUSION: The established

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method for detecting type I collagen mRNA in rats is sensitive

and specific. Realtime quantitative RTPCR based on SYBR Green

I is an excellent candidate as a standard detection method for

largescale application.

【Keywords】gene expression； polymerase chain reaction；

type I collagen；mRNA

【摘要】 目的： 基于双链嵌合荧光染料 SYBR Green I，建

立一种快速、 灵敏的检测大鼠 I 型胶原 mRNA 表达水平的实时逆转录聚

合酶链反应（RTPCR）方法. 方法： 提取大鼠肝脏总 RNA，RTPCR 扩增

I 型胶原基因部分片段，将其克隆入 pMD18T 载体用作参比品. 基于

SYBR Green I 双链嵌合染料建立检测大鼠 I 型胶原 mRNA 表达水平方

法. 其中对一系列连续稀释的参比品进行实时 PCR 分析，评价所建立

方法的检测灵敏度；对 PCR 产物的熔解曲线进行分析评价其特异性.

结果： 重组质粒构建成功，经测序鉴定，目的片段已插入 pMD18T 载

体内. 所建立的实时 RTPCR 方法的最低检测限度为 1 个拷贝/反应， 在

每反应 100~107 拷贝范围内， CT 值(C 代表 cycle， 代表 threshold； T

CT 值指荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数)与起始模板浓度具

有良好的线性关系，相关系数为 0.991. 结论：所建立的基于 SYBR

Green I 双链嵌合染料的大鼠 I 型胶原 PCR 检测方法具有敏感性高、

特异性强和线性检测范围广等特点，适用于进一步的各种组织的大量

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样本检测.

【关键词】 基因表达；聚合酶链反应；I 型胶原；mRNA

0 引言

近年来，肿瘤间质的来源及间质成分的变化［1］与肿瘤浸润

转移的关系［2］逐渐受到人们的重视；骨、牙齿及皮肤等发育［3］

的各个时期中各种主要组成成分的表达量的变化也成为发育和疾病监

控在基础研究方面的趋势. 而这些领域的研究热点常集中在基质金属

蛋白酶及其抑制剂的研究上，而对作为细胞外基质主要成分之一的 I

型胶原的表达变化却少有报道. 实时荧光 PCR 技术是目前最准确、重

现性最好和国际公认的核酸分子定量定性检测标准方法, 被广泛用于

转基因研究、基因表达研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域

［4-7］. 已出现的荧光定量 PCR 方法有多种，其中应用前景最广的方

法是 SYBR Green I 荧光染料法［8］ 和 TaqMan 探针法［9］. 本文基

于 SYBR Green I 荧光染料利用实时荧光 PCR 技术就建立检测大鼠 I

型胶原表达水平的方法进行探讨.

1 材料和方法

1.1 材料

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