构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3mAb的人源化Fab.doc

构建预设 CDR3 基因噬菌体抗体库筛选抗人
整合素anb3mAb 的人源化 Fab

作者：王臣 侯利华 杜桂鑫 李建明 陈溥言 童贻刚

【关键词】 噬菌体抗体库;,,整合素anb3;,人源化 Fab

［Abstract］ AIM: To construct phage antibody library

with predetermined CDR3 and to screen humanized Fab of antihuman

integrin anb3 monoclonal antibody (mAb) by epitope guided

selection. METHODS: LCDR3 gene of mAb E10 was inserted into human

light chain variable region gene library. Hybrid phage antibody

library was constructed by cloning E10 chimeric Fd gene and human

light chain variable region gene into pComb3. Humanized light

chain gene was obtained by screening against human integrin a

nb3. Likewise, humanized Fab were gained by panning human

phage antibody library, which was constructed by cloning

humanized light chain gene and human heavy chain Fd gene with

E10 HCDR3 into pComb3. RESULTS: Three humanized Fab clones was

obtained by screening hybrid phage antibody library and human

phage antibody library, which contained 2.1×106, 2×107 colony

forming units, respectively. Indirect ELISA and competitive

inhibition ELISA analysis demonstrated that three humanized Fab

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antibody had specific binding activity with human integrin a

nb3. The strongest antihuman integrin anb3 reactive D5

clone was sequenced and sequencing analysis showed that the V

k and VH were derived from VKIII and VHI, respectively.

CONCLUSION: Humanized Fab of antihuman integrin anb3 mAb has

been successfully obtained by phage display technology which

lays the foundation for further clinical research.

［Keywords］phage antibody library; integrin anb3;

humanized Fab

［摘 要］ 目的: 构建预设 CDR3 基因的噬菌体抗体库, 通过

抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素anb3 单克隆抗体(mAb)人

源化 Fab。方法: 将鼠 mAb LCDR3 重组到人轻链可变区文库中并与人/

鼠嵌合重链 Fd 基因配对构建杂合噬菌体抗体库, 用固相人整合素a

nb3 抗原筛选人源化轻链基因。 再用所获人轻链基因与移植有鼠 mAb

HCDR3 的人重链 Fd 基因配对构建人源噬菌体抗体库, 筛选人源化 Fab。

结果: 分别构建了库容为 2.1×106 和 2×107 的杂合噬菌体抗体库和

人源噬菌体抗体库, 筛选到 3 株人源 Fab 克隆。经间接 ELISA 及竞争

抑制 ELISA 证实, 能特异结合整合素anb3 抗原, 其中人源 D5 株

Fab 克隆的基因序列表明, 人轻链可变区基因属 VKIII 亚群, 人重链

可变区基因属 VH1 亚群。结论: 利用噬菌体抗体库技术, 成功地进行

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了鼠抗人整合素anb3 mAb E10 人源化的改造, 为进一步临床应用

奠定了基础。

［关键词］噬菌体抗体库; 整合素anb3; 人源化 Fab

鼠源单克隆抗体(mAb)为人类疾病的研究起到了重大的推动

作用, 但由于其应用于人体易产生人抗鼠抗体(HAMA)反应, 严重限制

了其临床应用。噬菌体抗体库技术作为抗体技术领域中的一项革命性

进展, 该技术自建立之日起就得到了广泛应用。目前也被公认是制备

抗体的高效技术平台［1, 2］ 同时该技术也为鼠 mAb 的人源化提供了 。

新的方法。Jespers 等［3］报道的抗原表位导向选择法的优越性, 在

于其可获得和原来鼠 mAb 针对同一表位的完全人源抗体。 王卓智等 4］ ［

曾运用该方法对抗 TNFa鼠 mAb 进行人源化, 但所获人源 mAb 的特异

性和亲和力难以得到保证, 在实验中常常难以获得满意的人源抗体。

Rader 等［5］利用上述抗原表位导向选择法构建了预设的抗体库, 经

对抗整合素anb3 鼠 mAb LM609 进行人源化改造, 取得了良好的效

果。即先用鼠 Fd 片段基因与含有鼠 mAb LCDR3 的人轻链基因配对构建

杂合噬菌体抗体库, 筛选人源化轻链。然后再用筛到的人源化轻链与

含有鼠 mAb HCDR3 的人 Fd 基因配对构建人源抗体库, 筛选人源 mAb

基因。该方法对人抗体可变区基因文库进行了预设, 将原鼠 mAb 的

CDR3 基因预先重组到人可变区文库中。由于可变区的 CDR3 是决定抗

体特异性的关键部位, 因而使可变区文库中模拟亲本鼠 mAb 的能力大

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