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猪瘟检测方法

猪瘟间接血凝试验操作方法
（一）试验材料
1．96孔110~120°V型医用血凝板
2．10~100微升可调微量移液器
3．塑料咀
4．猪瘟间接血凝抗原（猪瘟正向血凝诊断液），每瓶5毫升，可检测血清25~30头份
5．阳性对照血清，每瓶2毫升；阴性对照血清，每瓶2毫升
6．稀释液每瓶10毫升
7．待检血清每份0.2~0.5毫升（56℃水浴灭活30分钟）
（二）操作步骤
1．检测前，应将冻干诊断液，每瓶加稀释液5毫升浸泡7~10天后方可应用。
2．稀释待检血清：在血凝板上的第1孔~第6孔各加稀释液50微升。吸取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，依此类推直至第6孔混匀后丢弃50微升，从第1孔——第6孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64。
3．稀释阴性和阳性对照血清：在血凝板上的第11排第1孔加稀释液60微升，取阴性血清20微升混匀取出30微升丢弃。此孔即为阴性血清对照孔。
在血凝板上的第12排第1孔加稀释液70微升，第2——7孔各加稀释液50微升，取阳性血清10微升加入第1孔混匀，并从中取出50微升加入第2孔混匀后取出50微升加入第3孔……直到第7孔混匀后弃50微升，该孔的阳性血清稀释度为1512。
4．在血凝板上的第1排第8孔加稀释液50微升，作为稀释液对照孔。
5．判定方法和标准：先观察阴性血清对照孔和稀释液对照孔，红血球应全部沉入孔底，无凝集现象（—）或呈（+）的轻度凝集为合格；阳性血清对照应呈（+++）凝集为合格。
在以上3孔对照合格的前提下，观察待检血清各孔的凝集程度，以呈“++”凝集的待检血清最大稀释度为其血凝效价（血凝价）。血清的血凝价达到1：16为免疫合格。
“-”表示红细胞100%沉于孔底，完全不凝集
“+”表示约有25%的红细胞发生凝集
“++”表示50%红细胞出现凝集
“+++”表示75%红细胞凝集
“++++“表示90—100%红细胞凝集
6．注意事项
（1） 勿用90°或130°血凝板，以免误判。
（2） 污染严重或溶血严重的血清样品不宜检测。
（3） 冻干血凝抗原，必须加稀释液浸泡7~10天，方可使用，否则易发生自凝现象。
（4） 用过的血凝板，应及时冲冼干净，勿用毛刷或其他硬物刷洗板孔，以免影响孔内光洁度。
（5） 使用血凝抗原时，必须充分摇匀，瓶底应无血球沉积。
（6） 液体血凝抗原4~8℃贮存有效期四个月，可直接使用。冻干血凝抗原4~8℃贮存有效期三年。
（7） 如来不及判定结果或静置2小时结果不清晰，也可放置第2天判定
（8） 每次检测，只设阴性、阳性血清和稀释液对照各1孔。
（9） 稀释不同的试剂要素时，必须更换塑料咀。
（10）血凝板和塑料咀洗净后，自然干燥，可重复使用。
(李树春)

猪瘟病毒强弱毒鉴别诊断ELISA操作方法
（一）试验材料
1．猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原和猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原，分别供检测经猪瘟弱毒疫苗免疫后产生的抗体和感染猪瘟强毒后产生的抗体之用。
2．酶标抗体
3．猪瘟阳性、阴性血清
4．酶联板及其他必要的试剂。
（二）操作步骤
1．用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各作100倍稀释，以100微升分别加入做好标记的酶联板孔中，置湿盒于4℃过夜。
2．弃去孔内液体。用洗涤液冲洗酶联板3次，每次间隔3~5分钟，拍干。
3．用稀释液将待检血清作400倍稀释，每孔加100微升。同时，将猪瘟阳性、阴性血清以100稀释作对照，37℃培育1.5~2小时。
4．重复第2步。
5．用稀释液将兔抗猪IgG—辣根过氧化物酶结合物作100倍稀释，每孔加入100微升，37℃培育1.5~2小时。
6．重复第2步。
7．每孔加入底物溶液（每块板所需的底物溶液按邻苯二胺5毫克+底物缓冲液5毫升+30%过氧化氢18.75微升配制）100微升，室温下观察显色反应（一般阴性对照孔略微显色，立即终止反应，并以阴性孔作空白调零）。
8． 每孔加入终止液50微升，于酶联读数仪上测定490nm波长的光密度（OD）。
（三）判定标准
在猪瘟弱毒酶联板上：OD>0.2为猪瘟弱毒抗体阳性
OD<0.2为猪瘟弱毒抗体阴性
在猪瘟强毒酶联板上：OD≥0.5为猪瘟强毒抗体阳性
OD<0.5为猪瘟强毒抗体阴性
（四）注意事项
1．运输单抗纯化酶联抗原时，必须使用冰盒低温运输；猪瘟强弱毒单抗纯化酶联抗原在4℃保存6个月，在—18℃保存12个月。
2．配制洗涤液时，应使用新鲜蒸馏水或无离子水，每次洗板后尽量不使孔中有残余液体，以免影响结果。
3．底物溶液应临用前配制，待邻苯二胺完全溶解于底物缓冲液后再加过氧化氢，混匀后立即加入孔中。
1． 终止反应后，应立即读数。
(中国兽药监察所)
猪瘟反转录聚合酶链反应
1．材料准备：待检组织，匀浆器、氯仿、异丙醇、75%乙醇、生理盐水，RNA提取试剂盒（Omega），RT-PCR试剂盒（TakaRa）等。
引物：扩增猪瘟病毒E2基因中585bp基因片段，由上海生物工程公司合成。
序列为：上游引物P1：5’—CCTGCAAGGAAGATCACACG—3’
下游引物P2：5’—CCGTGTAGGTCACTGGTTCA—3’
仪器设备为：PCR扩增仪，电泳仪，凝胶电泳紫外检测仪。
2．操作步骤
2．1 样品采集：动物病死或扑杀后，取扁桃体、淋巴结和脾组织，-20℃冷藏。
2．2 样品处理：所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5生理盐水收集于离心管内，-70℃反复冻融三次，7000r/min，离心5分钟，取上清液。
2．3 RNA提取：依照Omega公司RNA提取试剂盒的操作程序提取总RNA。
2．4 RT-PCR操作程序：依照TakaRa公司的一步法RNA PCR试剂盒操作程序进行。
扩增条件为：50℃，反转录30分钟，94℃变性5分钟，进入循环，94℃ 50秒，72℃ 60秒，40个循环后72℃延伸10分钟。
3．RT-PCR产物检测：扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光下与标准分子量比较，如见585bp片段，初步诊断为阳性。