不同海拔下黄牛乳蛋白差异表达的蛋白组学分析.pdf

DOI:1网络首发时间：2 0 2 3-0 6-0 82023,53(09):1173-1182中国兽医科学2023,53(09)ChineseVeterinary Science0.16656/j.issn.1673-4696.2023.0154中图分类号：S852.23文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 96(2 0 2 3)0 9-117 3-10不同海拔下黄牛乳蛋白差异表达的蛋白组学分析余震1.2,潘阳阳1,2,王萌1,王立斌1,2,邱山桐1,2,高娜1,2,余四九1,2*（1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州1730070;2.甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心，甘肃兰州730070)摘要：通过对黄牛乳进行乳成分分析及TMT定量蛋白质组学分析，筛选不同海拔黄牛乳成分差异表达蛋白，结合DAVID数据库分别进行乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白（MFGM)的GO和KEGG富集分析，使用STRING在线工具和Cytoscape3.8.2软件构建不同海拔地区黄牛乳清、MFGM蛋白的蛋白质互作网络。结果，两种海拔中，38 50 m海拔地区（后记作HA)黄牛乳营养成分高于2 7 0 0 m海拔地区（后记作LA)黄牛乳；HA黄牛乳清蛋白、MFGM蛋白浓度显著高于LA黄牛乳清蛋白与MFGM蛋白。乳清蛋白中12 3个差异表达蛋白上调，12 2 个差异表达蛋白下调;MFGM蛋白中17 2 个差异表达蛋白上调,95个差异表达蛋白下调。黄牛乳清蛋白、MFGM蛋白共同参与免疫调控过程、代谢过程、发育过程；共同涉及的分子功能包括调节酶活性、能量结合、脂质结合。补体和凝血级联、溶酶体代谢、IgA产生的肠道免疫网络、抗原加工和呈递、B细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性是主要的免疫相关信号通路。结果表明,HA黄牛乳的蛋白浓度更高，可使犊牛血清总蛋白(STP)升高，从而可影响犊牛成年后的繁殖性能。HA黄牛乳清、MFGM蛋白可能在抑制肿瘤发生、增强宿主免疫防御的信号通路中发挥重要作用,LA黄牛乳汁在抑制炎症反应过程中发挥作用。关键词：海拔；黄牛；乳清蛋白；MFGM蛋白TMT定量蛋白质组学Proteomic analysis of differential expression of milk protein in yellowcattle at different altitudesYU Zhen-2,PAN Yang-yang-2,WANG Meng,WANG Li-bin-2,QIU Shan-tong*2,GAO Na-2,YU Si-ju.2*(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Technology and Research Center of Gansu Province for Embryonic Engineering of Bovine and Sheep&Goat,Lanzhou 730070,China)Abstract:In this study,TMT proteomics technology was used to analyze the differential proteomicsof whey protein and fat globule membrane protein of yellow cattle at different altitudes in Gannanarea,which laid a foundation for understanding the protein level differences and related molecularmechanisms of yellow milk at different altitudes,and also provided a channel for the optimization ofyellow cattle germplasm resources.The differentially expressed proteins of milk components in yellowcattle at different altitudes were obtained by TMT quantitative proteomics analysis.Combined withDAVID database,GO and KEGG enrichment analysis of whey protein and milk fat globule membrane protein(MFGM protein)were obtained respectively.Cytoscape 3.8.2 software was used to construct protein in-teraction network analysis of whey and MFGM proteins in yellow cattle at different altitudes.In re-sult,the concentration of whey protein and MFGM protein in relatively high altitude(3 850m)was signif-收稿日期：2 0 2 3-0 5-0 4；修回日期：2 0 2 3-0 6-0 5基金项目：国家自然科学基金项目（牛不同来源胚胎早期发育过程中LncRNAs介导Paraspeckle形成对细胞命运决定的调控机制，3197 2 7 6 0)；甘肃省科技重大项目（2 1DZ10NA001)；甘肃省重点人才项目（余四九团队2 0 2 2-2 0 2 4)作者简介：余震（1995-），男，甘肃平?人，硕士，研究方向为动物生殖生理，E-mail：46 414438 3 q q.c o m。*通讯作者：余四九，教授，博导，博士，研究方向为动物繁殖技术与动物胚胎工程，E-mail:。1174第53 卷中国兽医科学icantly higher than that in relatively low altitude(2 700m).123 differentially expressed proteins wereup-regulated and 122 differentially expressed proteins were down-regulated.In MFGM protein,172 dif-ferentially expressed proteins were up-regulated and 95 differentially expressed proteins weredown-regulated.The biological processes involved in whey protein and MFGM protein in cattle at differ-ent altitudes mainly included immune regulation process,metabolic process and development process.The molecular functions involved include regulating enzyme activity,energy binding,lipid binding,etc.Common cellular components include extracellular regions,membrane-bound organelles,and extra-cellular bodies.The complement and coagulation cascades,lysosomal metabolism,intestinal immune net-work produced by IgA,antigen processing and presentation,B cell receptor signaling pathway,NOD-likereceptor signaling pathway,and natural killer cell-mediated cytotoxicity were the main immune-relat-ed signaling pathways.The above results showed that the milk protein concentration of yellow cattle atrelativelyhigh altitude was higher,which could increase the serum total protein(STP)of calves,thus af-fecting the reproductive performance of calves in adulthood.Secondly,the whey and MFGM proteins ofyellow cattle at relatively high altitude may play an important role in signaling pathways that inhibittumorigenesis and enhance host immune defense.The milk of yellow cattle at relatively low altitudeplays a role in inhibiting the inflammatory response.Key words:altitude;cattle;whey protein;MFGM protein;quantitative proteomics of TMT*Corresponding author:YU Si-jiu,就海拔对牛乳的影响而言，JinhuiPu11发现高海拔奶牛乳生物功能和营养功能相比低海拔奶牛乳更为丰富，更适合作为生产高游离脂肪酸乳制品的原料奶。叶丹 2 发现耗牛乳中蛋白质的含量随海拔升高而增加。乳源蛋白的重要性体现在肉牛成年的生产性能和特牛生长发育方面。研究发现，不同来源的蛋白质（包括乳源蛋白、花生蛋白、小麦蛋白、大米蛋白以及大豆蛋白)中，对犊牛的生长发育及免疫影响最大的为乳源蛋白 3。且特牛出生后的免疫力几乎完全依赖于母体内的免疫球蛋白，而这部分免疫球白是通过初乳作为载体传递给犊牛的 4。本研究要探究的是不同海拔对黄牛乳蛋白成分的影响。本文研究的重点不在于探究可提供人类代乳的牛种，如奶牛、水牛、耗牛，而研究的重点是产奶量少但作为主要肉牛品种的黄牛。黄牛虽然乳量少，但肉用价值高，可通过研究海拔对乳成分的影响而了解不同海拔地区黄牛奶蛋白质的差异以及相关分子机理，也为黄牛种质资源的优化提供了渠道。因此，我们通过乳成分分析及组学研究，定量分析了38 50 m与2 7 0 0 m海拔地区黄牛乳中的乳清、乳脂肪球膜蛋白(MFGM5)蛋白质组,筛选鉴定了3850m与2 7 0 0 m环境下黄牛乳的营养成分及蛋白差异，并进行了GO生物学组成分析、KEGG功能富集和蛋白质一蛋白质互作网络分析。1材料与方法1.1黄牛乳为保证试验设计的准确性，在黄牛的品种选择上，本试验选择黄牛中的优质品种秦川牛作为研究对象。为保证气候一致，选用海拔落差大的甘肃省甘南藏族自治州夏河县进行采样。本试验共采集12 份秦川牛乳样品，HA与LA样品各6 头份，每份牛乳量均超过5mL。将采集的样品装人试管中，置于一2 0 的干冰泡沫箱中，转运回实验室置于一8 0 的超低温冰箱中保存。HA乳样采于甘南州夏河县阿木去乎镇，海拔38 50 m。LA乳样采于夏河县达麦乡，海拔2 7 0 0 m。1.2主要试剂及仪器TMTpro16标记试剂盒为ThermoFisher（美国)产品。预制胶为南京金斯瑞生物科技有限公司产品。胰酶为北京华利世科技有限公司产品。TEAB为Sigma(美国)产品。QExactiveHF、EA SY-n LC1000液相均为ThermoFisher(美国)产品。SDS-PAGE凝胶电泳仪为北京市六一仪器厂产品。全自动数码凝胶图像分析系统为上海天能科技有限公司产品。高pH分离液相色谱仪为Agilent(美国)产品1.3蛋白质的提取将采集的牛乳以9 0 0 0 r/min的转速在4下离心15min使牛乳分层，上层为乳脂，下层为乳清，沉淀为细胞碎片等不溶性杂质，收集乳脂部分和乳余1175震等：不同海拔下黄牛乳蛋白差异表达的蛋白组学分析第9 期清部分。将收集的乳清、乳脂部分再以10 0 0 0 0 g的转速于4离心6 0 min，下层为酪蛋白沉淀，收集上清液，加入6 倍体积的丙酮沉淀蛋白，一2 0 放置过夜。在4下以12 0 0 0 g的转速离心10 min,弃上清，再次加人沉淀洗液，待混匀充分后，以12 0 0 0 g的转速在4条件下离心10 min，重复4次。常温下干燥后，加人到蛋白沉淀裂解液中，于室温下复溶至沉淀完全溶解，复溶后样品分装储存于一8 0 1.4SDS-PAGE分析用SDS-PAGE分离乳脂样品中的蛋白质，得到分离凝胶，并进行考马斯亮蓝染色，染色后用凝胶图像分析系统成像。1.5胰蛋白酶消化根据测定的蛋白质浓度，每个样品取50 g蛋白质，并用裂解液将不同组别的样品稀释到相同的浓度和体积。利用丙酮沉淀蛋白质后一2 0 静置4小时以上。离心收集沉淀，然后复溶沉淀。加人胰酶消化过夜。将酶解后的样品冻干后一8 0 保存。1.6肽段标记冻干样品采用TMTpro试剂进行肽段标记，标记完成后于一8 0 保存。1.7反相色谱分离通过Agilent1100HPLC进行液相色谱分析。色谱柱为5m,用氨水将其pH调至10。收集洗脱液到离心管，反复收集样品。真空冻干、抽干，冷冻保存，用于后续色谱分析。1.8色谱条件与质谱条件1.8.1色谱条件样品以350 nL/min的流速上样到预柱,再经分析柱(7 5mX15cm）分离。流动相A相为H,O-FA（体积比99.9:0.1），流动相B相为ACN-FA（体积比99.9:0.1)。梯度洗脱条件：0 1min，2%6%B;152 min,6%35%B;5254 min,35%-90%B;5460 min,90%B。1.8.2质谱条件一级MS质量分辨率设为12 0 0 0 0，自动增益控制值设为3e6，最大注射时间为30 ms；质谱扫描设定为全扫描荷质比（m/z)范围350 16 50，并对其中15个最高峰进行MS/MS扫描；所有MS/MS图谱采集使用数据依赖型的正离子模式下的高能碰撞裂解完成，碰撞能量设为32;MS/MS的分辨率设为6 0 0 0 0，自动增益控制设为1e5，离子最大注射时间为54ms；动态排除时间设为40 s。1.9数据库检索数据采用ProteomeDiscover2.4（T h e r m o f is h e r公司)分析。具体搜库参数设置归纳于表1。表1质谱检索参数Table 1 Mass spectrometry retrieval parameters项目Items参数设置ParametersettingStaticmodificationTMT(N-term,K);Carbamidomethyl(C)DynamicmodificationOxidation(M),Acetyl(N-term)DigestionTrypsinInstrumentQExactiveHFMS1 tolerance10ppmMS2tolerance0.02DaMissed Cleavages2Databaseuniprot-taxonomy_9913.fasta1.10差异蛋白筛选采用TMT定量蛋白质组学技术对12 份乳汁样品，在可信蛋白基础上，共进行了多次重复试验。过滤标准为“1%FDR”。显著差异表达蛋白以Foldchange=土1.2 和P0.05两个条件进行筛选。1.11生物信息学分析对结果进行生信分析，包括蛋白功能注释，差异蛋白功能富集分析以及差异蛋白互作网络分析。2结果与分析2.1牛乳营养成分分析结果（表2)显示,HA黄牛乳脂肪、乳蛋白、乳糖、总固形物以及非乳脂固形物均高于LA黄牛乳。表2 HA黄乳与LA黄牛乳主要营养成分含量的比较Table 2 Comparison of main nutritional component contents in milk of HA yellow cattle with LA yellow cattle分组样品编号乳脂含量/%乳蛋白含量/%乳糖含量/%总固形物含量/%非乳脂固形物含量/%GroupsSampleNo.MilkfatMilkproteinLactoseTSSNFHA-34.084.055.6514.4510.373850m海拔HA-24.104.065.6614.5010.403850mHA-14.134.055.6414.5010.37altitude(HA)Mean土SD4.1030.0214.0530.0055.6500.00814.4830.023410.3800.014LA-33.933.335.0113.059.122700m海拔LA-23.953.345.0213.099.142700mLA-13.993.325.0013.099.10altitude(LA)Mean土SD3.9570.0253.3300.0085.0100.00813.0770.0199.1200.016*:P0.051176第53 卷中国兽医科学2.2蛋白质浓度表3显示，HA黄牛乳清蛋白浓度显著高于LA黄牛乳清蛋白浓度（P0.05,表4)。表3HA黄牛与LA黄牛乳清蛋白吸光度及浓度测定Table 3 Determination of absorbance and concentration of whey protein in high-altitude cattle and low-altitude cattle组别样品编号吸光度测定浓度/(gL-)真实浓度/(gL-)GroupsSampleNo.AbsorbanceTestedconcentrationTrueconcentrationHA-Q10.4470.36118.0503850m海拔HA-Q20.4860.39315.7103850 maltitude(HA)HA-Q30.4870.39415.760Mean土SD0.4730.0180.3820.01516.5061.091*LA-Q10.4650.37615.0302700m海拔LA-Q20.3890.31312.5302 700 maltitude(LA)LA-Q30.4730.38215.290Mean土SD0.4420.0380.3570.03114.2831.244*表4HA黄牛与LA黄牛MFGM蛋白吸光度及浓度测定Table 4 Determination of absorbance and concentration of MFGM protein in high-altitude cattle and low-altitude cattle组别样品编号吸光度测定浓度/(gL-)真实浓度/(gL)GroupsSampleNo.MeanabsorbanceTestedconcentrationTrueconcentrationHA-Z10.2300.1821.8203850m海拔HA-Z20.2360.1871.8703 850 m altitude(HA)HA-Z30.2170.1711.710Mean土SD0.2270.0080.180 0.0071.8000.067LA-Z10.1960.1541.5402700m海拔LA-Z20.1970.1541.5402 700 m altitude(LA)LA-Z30.1600.1241.240Mean土SD0.1840.0170.1440.0141.4400.1412.3可信蛋白PCA分析对原始数据按照Score Sequest HT0且uniquepeptide1进行筛选,并对可信蛋白进行主成分分析(PCA分析）。从PCA得分结果可以看出，样本全部处于95%置信区间内。组内样品点比较聚集，说明组内差异较小。HA黄牛乳清蛋白、MFGM蛋白与LA黄牛乳清蛋白、MFGM蛋白两组样品可以明显区分，说明两组样品之间差异显著2.4HA黄牛与LA黄牛乳清差异性表达蛋白定量分析2.4.1乳清蛋白SDS-PAGE电泳对两种不同海拔黄牛乳清蛋白、MFGM蛋白样品进行12%SDS-PAGE凝胶电泳,结果显示HA与LA黄牛乳中乳清蛋白、MFGM蛋白的主要条带清晰可见，表明乳清蛋白、MFGM蛋白的提取是有效的。2.4.2差异表达蛋白统计本研究共有12 份乳汁样品,编号分别为HA-Q-1、H A-Q-2、H A-Q-3、LA-Q-1、LA-Q-2、LA-Q-3、H A-Z-1、H A-Z-2、H A-Z-3、LA-Z-1、LA-Z-2、LA-Z-3。在可信蛋白基础上,采用TMT定量蛋白质组学技术对其进行了多次重复试验。乳清蛋白共有2 47 8 53张二级谱图生成下机，在“1%FDR过滤标准下，总共有2 991条肽段和6 51个乳清蛋白被鉴定到，获得差异蛋白2 45个，其中12 3个上调差异蛋白，12 2 个下调差异蛋白。MFGM蛋白共有2 50 455张二级谱图生成下机，有447 0 条肽段和990个MFGM蛋白被鉴定到，获得差异表达蛋白2 6 7个，其中17 2 个上调差异蛋白,95个下调差异蛋白。2.51HA黄牛和LA黄牛乳清蛋白的GO功能注释分析为了比较乳清蛋白在两种海拔地区的生物学功能,采用GO功能注释分析对HA黄牛和LA黄牛牛乳中2 45种差异表达乳脂蛋白进行注释。GO功余1177震等：不同海拔下黄牛乳蛋白差异表达的蛋白组学分析第9 期能注释分为细胞成分、分子功能和生物过程(图1)。差异蛋白所属细胞成分有150 个，其中富集极显著（P0.01)的有32 个，富集显著(P0.05)的有30个。上调蛋白与下调蛋白均以细胞外蛋白居多。主要细胞成分包括细胞外区域（extracellularregion）、溶酶体(lysosome)、顶质膜(apical plasmamembrane）、异源三聚体G蛋白复合物（heterotrimericG-proteincomplex）、刷状缘膜（brushbordermembrane）、乳糜微滴（chylomicron）、嗜铬颗粒（chromaffingranule）。差异表达乳清蛋白分子功能有30 3个，其中富集极显著（P0.01)的有6 7 个，富集显著（P0.05)的有12 1个。在分子功能富集分析中,上调蛋白与下调蛋白均以结合活性和抑制剂活性最多；差异表达乳清蛋白主要富集在丝氨酸型肽链内切酶抑制剂活性(serine-type endopeptidase inhibitoractivity）、蛋白质同二聚化活性（protein homodimerizationac-tivity）、G T P酶活性（GTPase activity）、G D P结合（G D P b i n d i n g）、小分子结合（small molecule bind-ing）、半胱氨酸型肽链内切酶抑制剂活性（cys-teine-type endopeptidase inhibitor activity）、脂多糖结合（lipopolysaccharidebinding）、内肽酶抑制剂活性（endopeptidase inhibitoractivity）、黄嘌呤脱氢酶活性（xanthine dehydrogenase activity）、蛋白聚糖结合(proteoglycan binding)等。差异表达乳清蛋白所参与的生物过程有8 2 7个，其中富集极显著(P0.01)的有149个，富集显著(P0.05)的有2 7 0 个。上调蛋白与下调蛋白参与最多的生物过程为免疫反应。主要生物过程包括先天性免疫应答（innate immune response）、内肽酶活性负调控(negative regulation of endopeptidase ac-tivity）、急性期反应（acute-phase-response）抗菌肽介导的抗菌体液免疫反应（antimicrobial humoral im-mune response mediated by antimicrobial peptide)、补体激活途径（complement activation pathway）、参与细胞蛋白质分解代谢过程的蛋白质水解（proteolysisinvolved in cellular protein catabolic process)、细胞对甲状腺激素刺激的反应过程（cellular response tothyroid hormone stimulus）、受体介导的内吞作用的正调节(positive regulation of receptor-mediated en-docytosis)。LA-Q_HA-Q(Total):Top30GOTermscategory600.3biological_processcellular_componentmolecular_function0.2400.1200.00orunueatdseactivityactivityractivityractivityeactivityeresponsel pathwaylysosomermembranemelanosomechylomicronGDPbindingsfiberassemblyg.ofuriglyerideGTPasea.clasical.catabolic processextracllularregioncG-protein csmall molecule bindingSJo1e endopeptidase inhibitoractivityxanthine dchydrogenase aheterotrimericserine-typeenegative regulaion of endopepidase aantimicrobial humoral immune responser图1HA黄牛和LA黄牛乳汁差异表达乳清蛋白GO功能富集情况Figure 1 Functional annotation analysis diagram of whey protein GO differentially expressed in milk of high altitude yellowcattle and low altitude yellow cattle2.6HA黄牛和LA黄牛MFGM蛋白的GO功能注释分析GO功能注释分为细胞成分、分子功能和生物过程。分析结果见图2。差异蛋白所属细胞成分有193个，其中富集极显著(P0.01)的有35个，富集显著(P0.05)的有41个。上调蛋白与下调蛋白均以细胞外蛋白居多；主要细胞成分包括细胞外空间（extracellularspace）1178第53卷中国兽医科学细胞外区域（extracellularregion）、顶质膜（apicalplas-ma membrane）、溶酶体(lysosome）、刷状缘膜（brushbordermembrane）、异源三聚体G蛋白复合物（het-erotrimeric G-protein complex)、内质网腔(endoplas-mic reticulum lumen）、黑素体（melanosome）嗜铬颗粒（chromafingranule）、免疫球蛋白复合物（im-munoglobulin complex)。差异表达MFGM蛋白分子功能有2 95个,其中富集极显著（P0.01)的有41个，富集显著（P0.05)的有12 5个。在分子功能富集分析中，上调蛋白与下调蛋白均以结合活性和抑制剂活性最多；差异表达MFGM蛋白主要富集在GTP酶活性(GT-Paseactivity）、G T P结合（GTPbinding）、丝氨酸型肽链内切酶抑制剂活性(serine-type endopeptidase in-hibitoractivity）、G D P结合（GDPbinding）、肝素结合(heparin binding)、小分子结合(small molecule bind-ing）、半胱氨酸型肽链内切酶抑制剂活性（cys-teine-type endopeptidase inhibitor activity）、免疫球蛋白受体结合（immunoglobulinreceptorbinding）、核糖核酸酶活性(ribonuclease activity）、肠杆菌素结合(enterobactin binding)等。参与的生物过程有8 0 6 个，其中富集极显著(P0.01)的有138 个，富集显著（P0.05)的有2 6 2个。上调蛋白与下调蛋白参与最多的生物过程为免疫反应。主要生物过程包括先天性免疫应答(innateimmune response)、内肽酶活性负调控(negative reg-ulation of endopeptidase activity）、补体激活途径（c o mp l e me n t a c t i v a t i o n p a t h w a y）、单次受精（singlefertilization）、对革兰阳性菌防御反应（defense re-sponse to Gram-positive bacterium）、急性期反应(a-cute-phaseresponse）、抗菌肽介导的抗菌体液免疫反应(antimicrobial humoral immune response mediat-edbyantimicrobialpeptide）、B细胞活化的正调控(positive regulation of B cell activation)、巨噬细胞迁移的调节（regulation of macrophage migration）、骨骼肌卫星细胞迁移(skeletalmusclesatellitecellmigration)。LA-Z_HA-Z(Total):Top30GOTerms0.3category60biological_processcellular_componentmolecular_function0.2400.120！0.0030dsactivitylumencactivityractivityabindingractivityeactivitybacteriumlysosome.circulatingmelanosomeGTP bindingGDPbinding.,classical pathway3cell activationecell migrationGTPaseinhibitoran.receptorbindingextraellar regioneG-proteincchromaffingenterobactin bindingsmall molecule bindingnofmacrophagerIaAnrsodcomplementactivation,defenseresponset图2HA黄牛和LA黄牛乳汁差异表达MFGM蛋白GO功能富集情况Figure2Functional annotation analysis of MFGM protein GO in milk of high-altitude cattle and low-altitude cattle2.7HA与LA黄牛乳清、MFGM蛋白的KEGG通路分析HA黄牛和LA黄牛差异表达乳清蛋白共参与222条KEGG通路，其中差异蛋白KEGG信号通路极显著（P0.01)的有37 个信号通路，显著（P0.05)的有15个信号通路。补体和凝血级联代谢通路(complement and coagulation cascades)、Ig A 产生的肠道免疫网络(intestinal immunenetwork for IgAproduction）f c y R介导的吞噬作用(Fc gamma R-me-diated phagocytosis）、f c s RI信号通路（Fc epsilon RIsignaling pathway）、抗原加工和呈递（antigen pro-cessing and presentation）、B细胞受体信号通路(Bcell receptorsignalingpathway）NO D 样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）、自然杀伤余1179震等：不同海拔下黄牛乳蛋白差异表达的蛋白组学分析第9 期细胞介导的细胞毒性(natural killer cell mediated cy-totoxicity）均与免疫系统相关；NF-kB信号通路(NF-kappaB signalingpathway）、PI3K-A k t 信号通路(PI3K-Akt signalingpathway）等与信号转导有关；溶酶体（lysosome）、红斑狼疮（systemic lupus ery-thematosus）是差异表达乳清蛋白最普遍涉及的代谢途径。HA黄牛和LA黄牛差异表达MFGM蛋白共参与2 18 条KEGG通路，其中差异蛋白KEGG信号通路极显著(P0.01)的有19个信号通路，显著(P0.05)的有2 8 个信号通路，前2 0 条通路如图3和图4所示。吞噬体(phagosome）、补体和凝血级联反应(complement and coagulation cascades）、肌动蛋白细胞骨架的调节（regulation of actincytoskeleton）、癌症通路（pathways incancer）、金黄色葡萄球菌感染（Staphylococcus aureus infection）、肺结核（Tuber-culosis）、癌症中的蛋白聚糖（proteoglycans incan-cer）、PI3K-A k t 信号通路(PI3K-Akt signaling path-way）、磷脂酶D信号通路(phospholipaseD signalingpathway)、Ra p l 信号通路(Rapl signaling pathway)、fcR介导的吞噬作用(Fcgamma R-mediatedphago-cytosis）、紧密连接(tight junction）、局灶性粘连（focaladhesion）Ra s 信号通路（Ras signalingpathway）等。其中,吞噬体、癌症通路、补体和凝血级联反应、肌动蛋白细胞骨架的调节、金黄色葡萄球菌感染是差异表达MFGM蛋白最普遍涉及的代谢途径。LA-Q_HA-Q(Total):KEGGEnrichment 20AfricantrypanosomiasisAmoebiasisAsthma-CholesterolmetabolismListHitsComplement and coagulation cascades6Dilatedcardiomyopathy9Fcgamma R-mediatedphagocytosis12Hematopoieticcell lineage15Intestinal immunenetworkforIgAproductionLeishmaniasisLysosome