chk1反义寡核苷酸增加HeLa细胞顺铂作用下凋亡敏感性.doc

chk1 反义寡核苷酸增加 HeLa 细胞顺铂作用
下凋亡敏感性

作者：朱克修，王佳，李玢，曹亚莉，韩晓兵

【摘要】 目的：通过反义封闭 chk1 基因，阻断细胞周期检

测点信号传导通路， 从而增加宫颈癌 HeLa 细胞对顺铂(DDP)的敏感性.

方法：采用 MTT 法检测梯度浓度 DDP 作用人宫颈癌细胞株 HeLa 24,48

和 72 h 后对细胞的生长抑制率. 以脂质体为载体将 chk1 正义链和反

义链转染 HeLa 细胞，用 Western Blot 测量 Chk1 蛋白的表达用流式

细胞仪和 TUNEL 法检测 DDP 作用后细胞凋亡率. 结果：DDP 对 HeLa 细

胞有生长抑制作用， 并有时间和浓度依赖性. 反义封闭 chk1 基因可抑

制 Chk1 蛋白表达（P<0.01） DDP 作用下细胞凋亡率为 54.1%,高 ，

于转染正义链的 34.2%（P<0.01）. 结论：反义封闭 chk1 基因可

增加 HeLa 细胞对 DDP 的凋亡敏感性.

【关键词】 Chk1 基因；反义核酸技术；宫颈肿瘤；顺铂

【Abstract】 AIM: To investigate the effect of chk1 gene

in cisplatin resistance of cervical cancer to block the signal

transduction pathways of cell cycle checkpoint, by targeting

chk1 gene using antisense oligonucleotide, so as to enhance the

drug sensitivity of cervical cancer HeLa cells to DDP. METHODS:

The proliferation inhibition rates of HeLa cells by DDP in

different concentrations were measured by MTT assay.

1

Oligonucleotide was transfected into HeLa cells.The expression

of Chk1 was observed by Western Blot. The apoptosis rate of HeLa

cells induced by DDP was investigated by flow cytometry and TUNEL.

RESULTS: The growth inhibition rate of HeLa cells increased

gradually in a time and concentration dependent manner.

Transfection with antisense oligonuleotide targeting chk1

inhibited the expression of Chk1 protein (P<0.01), and the

apoptosis rate (54.13%) was significantly higher than that of

the sense blocking (34.20%, P<0.01). CONCLUSION: Antisense

blocking of chk1 increases the apoptosis sensitivity of HeLa

cells to DDP.

【Keywords】chk1 gene； antisense nucleic acid technology;

cervix neoplasms; DDP

0 引言

宫颈癌是世界范围内女性第二大恶性肿瘤. 近年来以顺铂

（cisplatin，DDP）为核心的联合化疗在宫颈癌治疗中取得了一定进

展. 有研究认为，细胞周期检测点途径主要由 ATM，ATR Chk1/2

Cdc25A ， Cdc25B ， Cdc25C 轴 组 成 ［ 1 ］， 细 胞 周 期 检 测 点 激 酶

1(checkpoint kinase1，Chk1)属于丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞周期检

测中最关键的效应蛋白激酶［2］. 以 chk1 为作用靶点,干扰细胞损伤

修复机制,提高肿瘤治疗的敏感性可能成为一种有效的治疗选择. 我

们以 chk1 反义寡核苷酸链转染 HeLa 细胞，观察其化疗后的凋亡敏感

2

性.

1 材料和方法

1．1 材料

人宫颈癌 HeLa 细胞株由西安交通大学医学院第一附属医院

临床研究医学分子中心提供. 在 37℃, 50 mL/L 的 CO2 条件下用含 100

mL/L 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基培养. RPMI 1640 购自 Gibco 公司；

胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；MTT 购自 Amressco

公司；转染试剂 LipofectamineTM 2000 购自美国 Invitrogen 公司；

鼠抗人 Chk1 mAb 购自 Neomarkers 公司；辣根酶标记的羊抗鼠抗体购

自博士德公司；ECL 购自 Amersham Bioscience 公司；Annexin V

FITC 试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；原位细胞凋亡检测试

剂盒购自华美生物公司.

1．2 方法

实验分 4 组：正常对照组(A 组)，细胞未经任何处理；空脂

质体组(B 组)；转染 chk1 正义寡核苷酸链组(C 组)；转染 chk1 反义寡

核苷酸链组(D 组). B~D 组转染后用 20 mmol/L DDP 处理 24 h.

1．2．1 MTT 法检测

DDP 对细胞的生长抑制率取对数生长期的 HeLa 细胞，调整细

胞密度 5×107/L，接种于 96 孔板, 200 mL/孔,培养 24 h 后 DDP 终

浓度为 10,20,40,80 和 160 mmol/L,每个浓度设 4 个平行孔，并同时

设阴性对照(不加药物)和空白对照（无细胞） 别于作用 24,48 和 ，分

72 h 后加入 5 g/L 的 MTT 溶液，20 mL/孔，继续培养 4 h 后，吸去

3