博士后出站研究报告.docx

分类号 密级
U D C 编号
南方医科大学
博士后研究工作报告
结构及功能性鉴定与类风湿关节炎相关的二型胶原蛋白特异性、
HLA-DRB1*0405限制型T细胞表位
Functional and Structural Characterization of an
HLA-DRB1*0405-restricted T cell Epitope from Type II Collagen Relevant to
Rheumatoid Arthritis
张娜茹
工作完成日期 2015年7月至2017年12月
报告提交日期 2018年1月
南方医科大学（广东）
2018年1月
16

结构及功能性鉴定与类风湿关节炎相关的二型胶原蛋白特异性、
HLA-DRB1*0405限制型T细胞表位
Functional and Structural Characterization of an HLA-DRB1*0405-restricted T cell Epitope from Type II Collagen Relevant to Rheumatoid Arthritis
博士后姓名：张娜茹
流动站（一级学科）名称：药理学
专业（二级学科）名称：抗炎免疫药理学
研究工作起始时间 2015年7月1日
研究工作期满时间 2017年12月31日
南方医科大学人事部（广东）
2018年1月
内容摘要
类风湿关节炎（RA）是由T细胞介导的与人类主要组织相容性复合物II类分 子（MHC II）密切相关的一种自身免疫性疾病。位于东亚地区的类风湿关节炎 患者约30-40%携带HLA-DRB1*0405等位基因。截至目前，二型胶原蛋白（CII） 被认为是引发该疾病的主要自身抗原之一，然而该蛋白的T细胞表位及它是如 何与HLA-DRB1*0405分子结合进而相互作用的尚未被科研工作者报道。通过 多肽竞争结合实验，我们发现了一条来源于CII的多肽hCII931-949与 HLA-DRB1*0405分子具有很高的结合力，然而已被证实的HLA-DRB1*0401分 子的T细胞表位hCII259-273并不能结合HLA-DRB1*0405分子。经过E266L 位点的氨基酸替换hCII259-273_E266L与HLA-DRB1*0405分子的结合力大幅 度增强。我们进一步证实了 hCII931-949与HLA-DRB1*0405分子的主要结合 位点并得到了 DRB1*0405-hCII931-949的晶体结构。CII特异性， HLA-DRB1*0405分子限制型T细胞表位的鉴定为类风湿关节炎疫苗的研发和 临床应用奠定了科学基础。
关键词：类风湿关节炎，主要组织相容性复合物，HLA-DRB1*0405,二型胶原 蛋白，T细胞表位，
Abstract
Rheumatoid arthritis is a T cell dependent autoimmune disease with a strong association with the major histocompatibility complex class II (MHC II) gene. Up to 30-40% of the East Asian RA patients possess HLA-DRB1*0405 allel which is associated with the disease. A joint protein that has been suggested to play a role in the onset of arthritis is type II collagen (CII) but it is so far unknown how the relevant peptide is bound and recognized when presented by HLA-DRB1*0405 allele. We have now identified how hCII931-949 peptide from human CII binds to the HLA-DRB1*0405 allele by competitive peptide binding assay and crystal structure. The DRB1*0405 molecule was found to bind the hCII931-949 peptide but with dramatically reduced affinity to the well identified HLA-DRB1*0401 T cell epitope hCII259-273. The E266L amino acid substitution at P4 pocket of the hCII259-273 peptide increased the binding affinity with HLA-DRB1*0405 molecule. The key residues that are important for HLA-DRB1*0405 binding were identified. Furthermore, we got the crystal structure of HLA-DRB1*0405 complexed with hCII931-949 peptide. The CII-specific, HLA-DRB1*0405 restricted T cell epitope identification might lay a scientific foundation for the RA vaccine development and clinical use.
Keywords: Rheumatoid arthritis; MHCII; HLA-DRB1*0405; type II collagen (CII);
T cell epitope
目次
1 .引言 9..
1.1 类风湿关节炎的研究意义 9
1.2 类风湿关节炎的国内外研究现状 11
1.2.1 类风湿关节炎的遗传因素 11
1.2.2 类风湿关节炎的自身抗原及其T细胞表位 12
2 .实验材料与方法 1. 4
2.1 实验材料 14
2.1.1 实验试剂与耗材 14
2.1.2 主要仪器 15
2.2 实验方法 16
2.2.1 Eco〃DH5a化学感受态细胞的制备 16
2.2.2 PCEP4-DRA1*0101 及 PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut 表达质粒的构建与鉴定……16
2.2.3 质粒共转染 ExpiHEK293F 细胞以表达 DRB1*0405-hCLIPmutd 蛋白 16
2.2.4 DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白的纯化 17
2.2.5 西方印迹法鉴定DRB1*0405-hCLIPmut蛋白 17
2.2.6 多肽竞争结合实验 19
2.2.7 HLA-DRB1*0405-hCn931-949复合物结晶及其晶体结构解析 20
2.2.8 从RA病人全血中提取基因组DNA 20
2.2.9 从RA病人抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC) 21
2.2.10 酶联免疫吸附实验(ELISA) 22
2.2.11 统计处理和分析 22
3 .实验结果与分析 2. 2
3.1 表达质粒获得成功构建 22
3.2 西方印迹法鉴定HLA-DRB1*0405-hCLIPmut蛋白获得成功表达 24
3.3 对影响蛋白表达量的转染条件进行饿优化 24
3.4 多肽竞争结合实验证实HLA-DRB1*0405分子可特异性结合hCII931-949多肽 24
3.5 P-2、P1、P4和P8是hCII931-949多肽与HLA-DRB1*0405分子结合的主要位点..…27
3.6 HLA-DRB1*0405分子与hCII931-949多肽复合物的晶体结构 28
3.7 PBMC体外刺激实验 29
4 . 讨论 3..0
5 .结论 3..4
6 .致谢 35
7 .参考文献 36
8 . 结尾 39
图表清单
图 1 10
图 2 20
图 3 (A-B) 23
图 4 24
图 5 24
图 6 (A-C) 26
图 6(D) 27
图 7 28
图 8 29
图 9 30
英文缩略词对照表
Alanine A
Antigen presenting cell APC
Collagen-induced arthritis CIA
Collagen type II CII
Enzyme linked immunosorbent assay ELISA
Glycine G
Glutamine Q
Hemagglutinin HA
Human leukocyte antigen HLA
Major histocomplex class II MHC II
Optical density OD
Pheripheral blood mononuclear cell PBMC
Phenylalanine F
Rheumatoid arthritis RA
Proline P
Shared epitope SE
T cell receptor TCR
Theronine T
结构及功能性鉴定与类风湿关节炎相关的二型胶原蛋白特异性、
HLA-DRB1*0405限制型T细胞表位
1. 引言
1.1 类风湿关节炎的研究意义
类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis,RA)是一种以慢性滑膜炎为主的自身 免疫性疾病，主要影响腕部、手、膝盖、踝和脚的小关节，然而在15-25%的患 者中也可能会影响到身体的其它器官，比如眼睛、皮肤、心脏、肾脏和神经系 统。截至2016年底，中国的RA患者总数高达6000万。RA发病率及致残率 都非常高，对人类健康造成非常严重的威胁，被称为“不死的癌症”。目前临 床上采用的药物治疗主要包括非甾类抗炎药、慢作用抗风湿药 (Disease-modifying anti-rheumatic drugs， DMARDs)、免疫抑制剂、生物制 剂及植物药等，治疗的主要目的在于减轻关节炎症反应，抑制病变发展及不可 逆骨质破坏，尽可能保护关节和肌肉的功能，最终达到缓解病情或降低疾病活 动度的目标。但是，众多RA患者使用上述药物几年后常常会出现明显的毒副 作用以及耐药性，使得多数患者的病情不能得到长期有效的控制。迄今为止， 没有一种药物可以完全治愈RA，因而发现新的治疗性药物是目前研究的重点。
到目前为止，RA的病因尚未完全明确，但研究发现该疾病与遗传因素、微 生物感染、激素刺激、吸烟、饮食等很多因素有关。由于RA是一种自身免疫 性疾病，自身抗原的确定显得尤为重要。人体内存在多种关节特异性蛋白，例 如：二型胶原蛋白(Collagen type II, CII)、人体软骨糖蛋白(HCgp39)、瓜 氨酸化丝聚蛋白和波形蛋白等等。目前CII被认为是最有可能的自身抗原之一， 因为该蛋白是组成透明软骨的主要成分，组成该蛋白的赖氨酸和脯氨酸位点可 被羟基化继而糖基化，这种翻译后修饰的蛋白可被机体视为外来抗原，从而诱 导自身抗体的产生。相关研究显示，在RA患者的血清和滑膜液中可检测到CII 的抗体［1］。而在小鼠、大鼠和灵长类胶原蛋白诱导的关节炎（Collagen-induced arthritis, CIA）动物模型中异源CII可诱发RA疾病的产成，例如，鸡来源的CII 可诱导恒河猴和普通狨猴产生类似RA的症状，而大鼠来源的CII可使小鼠产 生类似RA的症状［2］，因此，CII目前被认为是最主要的自身抗原之一。此外， 在RA患者发炎的关节滑膜处存在大量活化的CD4+ T细胞，充分说明T细胞 介导了该自身免疫性疾病的发生。其可能的机制是关节滑膜处的CII中某个翻 译后修饰肽段被抗原递呈细胞（APC）细胞膜表面表达的主要组织相容性复合 物（MHC）II分子识别，并被递呈到CD4+T细胞受体（TCR）继而将T细 胞活化（见图1）。在小鼠模型中，I-Aq限制性CII主要抗原决定区CII263-271 已被发现［3］，并且这个表位与MHC II和T细胞受体（T cell receptor, TCR）之 间的结合也获得了成功鉴定［4］。因此，作用于RA患者的CD4+T细胞的CII 主要抗原决定区的确定显得至关重要。

图1.抗原递呈细胞（APC）与CD4+T细胞之间的相互作用。APC递呈的MHCII分子与
之结合的多肽复合物被CD4+ TCR识别，在共刺激分子的作用下将T细胞活化。
HLA-DRB1共享表位区（Shared epitope, SE）是人们目前发现的与RA最密 切相关的遗传因素之一［5］。然而，这一共享表位区具有种族差异性：在欧洲RA 患者中HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401 和HLA-DRB1*0404基因型所占比 重较大，而在亚洲RA患者中（在中国、日本、韩国人群尤为显著）约30-40% 的患者携带HLA-DRB1*0405等位基因［6-8］。在CIA模型和HLA-DRB1*0101, HLA-DRB1*0401或HLA-DRB1*0404等位基因携带者的RA病人中间，自身反 应性T细胞能够识别同一条CII260-273肽段［3］。位于264位点的赖氨酸（K264） 能够被羟基进而糖基化。研究证实T细胞识别糖基化的CII多肽在关节炎产生方 面起到了非常重要的作用［9］。Balik等人研究表明在CIA动物模型中，糖基化 CII259-273/A复合物有效抑制了关节炎的产生［10］。该研究主要针对携带 HLA-DRB 1 *04（主导基因型的亚洲RA患者，旨在确定CII特异性， HLA-DRB1*0405限制性T细胞表位，该表位的确定将为RA疫苗的研发奠定科学 基础。
1.2 类风湿关节炎的国内外研究现状
1.2.1 类风湿关节炎的遗传因素
RA是一种相对复杂的多因素导致的慢性自身免疫性疾病，环境因素比如 高钠摄入、吸烟或某些病菌或病毒感染均可以引起RA的发病，而遗传因素占 30%-50%［11］。位于第6号染色体短臂上的21.31区（6p21.31）的HLA复合体 目前被认为是与该疾病最为密切相关的遗传因素之一。Stastny于1978年首次 证 实 HLA-DRB1*0401 基因与 RA 相 关［12］， 1986 年，Nepom 发现 了 HLA-DRB1*0404基因也与RA存在着一定关联性［13］。目前研究表明与RA相 关的等位基因包括：HLA-DRB1*0101、*0102、*0401、*0404、*0405、*0408、 *0409、*0410、*1001、*1402、*1406 和*1409 [11],这些等位基因在 HLA-DR 分子8链位于70-74位点的第三超变区共同拥有一个相似的表位： QRRAA-*0101、*0102、*0404、*0405、*0408、*0410、*1402、*1406； QKRAA-*0401或者RRRAA-*1001[5]。这一共享表位区大大影响了与多肽的 结合以及被CD4+T细胞的识别。而HLA-DRB1*0402 (DERAA)则被列为保护 基因型[14]。相关研究证实该共享表位区在种族之间存在很大的差异：在欧洲 RA患者中，基因型为HLA-DRB1*0101、*0401和*0404的比重较大[8],然而 在亚洲RA患者中，约30-40%的患者携带HLA-DRB1*0405等位基因，该基因 所占比重最大。相关文献报道，HLA-DRB1*0405基因尤其与韩国，日本和中 国的RA患者密切相关。而全球大约有11.9%的正常人群携带HLA-DRB1*0405 等位基因[15]。因此，该项目研究的出发点是重点针对HLA-DRB1*0405基因 型阳性的RA患者设计个体化治疗研究方案，其中CII特异性，HLA-DRB1*0405 限制型T细胞表位的鉴定是首要任务。
1.2.2 类风湿关节炎的自身抗原及其T细胞表位
RA认为是由关节内自身抗原引发的，人体内存在多种关节特异性蛋白，例 如：CII、蛋白聚糖、HCgp39、瓜氨酸化丝聚蛋白和波形蛋白等等。尽管经过 数年的研究，引发RA的自身抗原到目前为止尚未给出一个定论，然而在诸多自 身抗原中，01目前被认为是引发RA的最潜在的自身抗原，因为CII是构成关节 透明软骨的主要蛋白，在3%-27%RA患者的血清中可检测到CII的特异性抗体 [16],而且在最常用到的CIA动物模型中用CIW诱发小鼠产生关节炎。其中CII 蛋白的翻译后修饰在诱发炎症过程中起到了至关重要的作用。
RA患者发炎的软骨组织和滑液中含有大量活化的CD4+ T细胞［17］,并且自 身反应性T细胞的数量与患者的病情呈现一定的关联性［18］。现在研究明确的是 在Aq和DR4转基因小鼠模型中，位于CII 264和270位点的两个赖氨酸可羟基化 继而糖基化，这一修饰可被丁细胞识别，从而诱发CIA或者对自身C^产生免疫 耐受［19, 20］。目前研究最多的HLA-DRB1*040分子与RA相关的T细胞表位为 CII 261-273,并且二者之间的亲和力以IC50表示为180nM［21］。另有文献报道在 HLA-DRB1*0401和*0101转基因CIA动物模型中自身反应性T细胞能够识别CII 蛋白259-273段表位［22］，这段表位与Aq相结合。T细胞可以特异性识别这段翻 译后修饰表位的现象同样存在于基因型为DR4的RA患者中［17］，这一发现表明 针对表位的特异性治疗可能会给RA患者带来光明。
然而种族差异，不同的种族携带不同的HLA-DRB1分子，不同的 HLA-DRB1分子结合的T细胞表位也会存在一些差异。据相关文献报道，可以 结 合 HLA-DRB1*0405 分 子 的 多 肽 包 括 CII 256-271 ： GEPGIAGFKGEQGPKG［23］、CII 429-442: GGVGPIGPPGERGA、CII 593-610: SGFQGLPGPPGPPGEGGKP 、 和 CII 1064-1081: RGFTGLQGLPGPPGPSGD［24］，然而只有 CII 1064-1081 这条多肽能够刺激 67% 的携带HLA-DRB1*0405等位基因的RA患者的PBMC产生IL-2和IFN- Y ［25］, 说明CII 1064-1081是HLA-DRB1*0405分子最有可能的T细胞表位。基于此项 研究，我们根据CII的三螺旋结构重新命名多肽hCII931-949,公司合成并通过 一系列多肽竞争结合实验和晶体结构首次从结构和功能上鉴定了 CII来源的 HLA-DRB1*040汾子限制型的T细胞表位。
2. 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验试剂与耗材
hCII931-949 (GHRGFTGLQGLPGPPGPSG); hCII931-945
(GHRGFTGLQGLPGPP) 及其被丙氨酸逐一位点替换的多肽; hCII259-273 (GIAGFKGEQGPKGEP); hCII259-273_P4E266L (GIAGFKGLQGPKGEP); HA306-318 (PKYVKQNTLKLAT)以及生物素标记的 hCLIP (Biotin-Ahx-hCLIP: Biotin-Ahx-KPVSKMRMATPLLMQA)多肽均由 Biomatilk 公司合成，每条多肽 的 纯 度都在 95% 以 上。HLA-DRA*0101, HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 和 HLA-DRB1*0405-hCII931-949 序列由德国 Eurofins Genomics 公司合成。质粒 小提，大提试剂盒和QIAamp DNA blood Midi Kit均购自QIAGEN公司。10,000 X Gelred nucleic acid gel stain 贝购自 Biotium 公司。Expi293FTM 细胞,Expi293 蛋 白表达培养基，Opti-MEM，RPMI 1640 培养基，L-Glutamine,重组 human IL-2 蛋白，羧苄青霉素，青霉素-链霉素，NuPAGE 4-12% Bis-Tris蛋白分离胶和IFN gamma human uncoated ELISA kit 均购自 Thermo fisher scientific 公司。 FectoPROTM转染试剂购自Polyplus公司。组氨酸标签银柱亲和层析柱，HiLoad 16/60 Superdex 200 pg凝 胶过滤 预装柱，Vivaspin 20 30kDa蛋白 浓缩管， Amersham hyperfilm ECL 化学发光试剂盒和 Ficoll-paqueTM plus 均购 自 GE Healthcare公司。辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的山羊抗 鼠二抗购自 SouthernBiotech 公司。DELFIAEu-N1 Streptavidin 购自 Perkin Elmer 公司。5ml, 10ml和25ml吸管均购自Sarstedt公司。HPLC级纯水购自山海默 恩化学科技有限公司。ELISACostar3590酶标板购自VWR公司。
2.1.2 主要仪器
冰箱 BCD-215KAV DZHaier
冰箱 BCD-573WY-C Ranshen
-80℃超低温冰箱88000 Thermo Fisher Scientific
磁力搅拌器 GL-3250C Kylin-Bell Lab Insruments 抗体孵育摇床 TSC-8 Qiliv BEI ERYIQIZHI 水平摇床 TS-1 Qiliv BEI ERYIQIZHI 电泳仪 BG-Power6000 BAYGENE
蛋白电泳槽 Mini-protean Tetra Bio-RAD
DNA 电泳槽 Wide Mini-Sub cell GT Bio-RAD
台式离心机 5810R Eppendorf
落地式高速离心机 Avanti J-E BECKMAN COULTER 金属浴锅 BYQ6044E-216 BIOER TECHNOLOGYCO CTD 加热恒温水浴锅HWS12/HWS28上海一恒科技公司 涡旋振荡器 Mixer V6 ESSENSCIEN
手掌离心机 XK-400 珠海黑马医学仪器有限公司
超高灵敏度化学发光成像系统ChemiDoc touch美国Biotek G1000基因扩增仪TC-96/G/H（bB杭州博日科技
PH测量仪 S210梅特勒-拖利多仪器（上海）有限公司 分析天平 220g ME203E METTLER TOLEDO
37℃ CO2 培养箱 HF90/HF 240 Thermo Fisher Scientific 恒温摇箱 ZWY-211C ZHCHENE
制冰机 XB-130-FZ/R134A GRANT
烤箱 HH-811-500 上海市跃进医疗器械厂
倒置显微镜 CKX31 Olympus
酶标荧光多功能检测仪Synergy H1美国Biotek
AKTApure 蛋白纯化仪 GE healthcare
2.2 实验方法
2.2.1 E.co〃DH5a化学感受态细胞的制备
取一管商品化的E.coli DH5a化学感受态细胞，在制备好的LB固体培养平板 上划线，将平板置于37℃孵育一晚以获得单克隆。挑取单克隆到5ml LB液体 培养基，置于37℃摇床培养一晚。第二天，接种2ml培养过夜的细菌培养液到 200ml新鲜的LB液体培养基，置于37度摇床继续培养至OD600=0.4。将细菌 培养液转移至500ml离心瓶于3000g,4℃离心15分钟。弃掉上清，加入20ml 0.1MCaCl2重悬，冰浴30分钟后于3000g,4℃离心10分钟。加入4ml含有15% 甘油的0.1M CaCl2重悬细胞，分装细胞然后置于-80℃低温保存。
2.2.2 PCEP4-DRA1*0101 及 PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut 质粒的构建及鉴定
HLA-DRA1*0101 和 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 基因序列送公司合成后， 酶切并连接到PCEP4表达载体，以热休克的方法转化到DH5a化学感受态细胞 中，37℃培养1小时，取菌液涂板。第二天，从LB平板中挑取单克隆，37℃ 培养过夜后抽提质粒，然后通过双酶切和测序的方法共同鉴定质粒序列的准确 性。
2.2.3 质粒共转染ExpiHEK293F细胞以表达DRB1*0405-hCLIPmut蛋白
转染前一天准备ExpiHEK293F细胞，浓度调整为1x106/ml后放置37℃二 氧化碳细胞培养箱悬浮培养。24小时后，在一个含有Opti-MEM培养液的试 管中加入FectoPRO转染试剂，漩涡混匀。在另一个含有Opti-MEM培养液的 18

试管中按一定比例加入 PCEP4-DRA1*0101 及 PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut质 粒并漩涡混匀。然后把两个试管的液体混合并漩涡混匀，室温静置15分钟后， 把混合物逐滴加入ExpiHEK293F细胞培养液中，轻轻混匀。转染后的细胞放 到37℃二氧化碳细胞培养箱继续培养。
2.2.4 DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白的纯化
转染5-6天后，待细胞的存活率为80%左右终止细胞培养，离心细胞培养 液后收取上清，通过0.45 ^m的滤膜过滤，DRB1*0405-hCLIPmut蛋白经AKTA 纯化系统(镍离子亲和层析和尺寸排阻色谱法)纯化。首先用含有50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazole 的平衡液平衡 His-Trap Excel 柱子， 然后上样，最后用含有 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazole 的洗 脱液洗脱蛋白，洗脱下来的蛋白经过10KD Amicon Ultra centrifugal filter units 浓缩后再经HiLoad Superdex 200 Pg纯化柱去除蛋白聚集体。纯化后的蛋白可 用一抗Mouse anti-DR和二抗anti-mouse-HRP经下述西方印迹法鉴定。
2.2.5 西方印迹法鉴定DRB1*0405-hCLIPmut蛋白
(1)常用缓冲液及其配制
① 30％丙烯酰胺溶液
丙烯酰胺 29 g
甲叉丙烯酰胺 1 g
蒸馏水 100 ml
搅拌器搅拌溶解，待完全溶解后，过滤，4℃避光储存备用。
②2x上样缓冲液(pH6.8)
62.5 mM Tris-HCl pH 6.8，2%w/vSDS，10% 甘油，50 mM 供巯基乙醇， 0.01% w/v 溴酚兰。取 1 M 的 Tris-HCl (pH 6.8) 0.625 ml，SDS 0.2 g，甘油 1 ml，
彷巯基乙醇0.5 ml,溴酚兰0.001g,用水补加至5 ml。
③Tris-甘氨酸电泳缓冲液
25 mM Tris碱，250 mM甘氨酸，0.1%w/vSDS。可配成10*的储存液，900 ml ddH2O中溶解30.2 g Tris碱和188 g甘氨酸，然后加入100 ml w/v 10% SDS， 用 ddH2O 补至 1000 ml。
④电转移缓冲液
25 mmol/L Tris 碱，0.2 mmol/L 甘氨酸，0.037% w/v SDS，20%甲醇（pH 8.5）。 可配成10*储液，900 ml ddH2O中溶解58 g Tris碱，29 g甘氨酸和3.7 g SDS， ddH2O补足至800 ml。用时取80 mL 10*储液用ddH2O稀释至800ml，加入 200ml 甲醇，4℃预冷备用。
⑤10*Tris-盐缓冲液（TBS）
24.2 g Tris碱，80gNaCl,加入800 ml去离子水，用稀HCl调pH至7.6, 加ddH2O至总量1000 ml。使用时，稀释成1*TBS溶液,加入0.1%的Tween-20， 即成TBST洗涤液。
⑥封闭液
1*TBS含0.1% Tween-20和5% w/v脱脂奶粉，搅拌溶解。
⑦抗体稀释液
1*TBS含0.1% Tween20和5% w/v脱脂奶粉，搅拌溶解。 （2）免疫印迹操作步骤
①制备好的样品经比色法测定蛋白浓度，加样，进行4-12%的SDS-PAGE凝胶 电泳1.5-2小时（恒流，16mA/gel），保证所加样品蛋白总量一致。
②将SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白用Bio-Rad微型电转移系统，于冰上 转移至硝酸纤维素膜上（电转移时间和电压因检测蛋白分子量而定）。
③转膜结束后，将硝酸纤维素膜置于平缓摇动的摇床上，以20 ml封闭缓冲液 室温下封闭1小时或4℃封闭过夜。
④5 ml TBST洗膜5次，每次3分钟。
⑤一抗Mouseanti-DRL243单克隆抗体用抗体稀释液2000倍稀释在摇床上 室温孵育1小时，确保抗体稀释液能完全覆盖膜。
⑥用25 ml TBST洗膜5次，每次3分钟。
⑦HRP标记的羊抗小鼠二抗用抗体稀释液30000倍稀释，在摇床上室温孵育1 小时，确保抗体稀释液能完全覆盖膜。
⑧25 ml TBST振荡洗膜5次，每次3分钟。
⑨膜稍沥干后加入化学发光试剂（125 ^l/cm2,用前30分钟将A、B液混合）室 温孵育1分钟左右，迅速用保鲜膜包好后置于暗盒内与X胶片贴在一起进行曝 光，曝光时间依发光信号强弱而定，10秒到10分钟左右。X胶片经显影、定 影后晾干，图片扫描后保存。
2.2.6 多肽竞争结合实验
先将多肽在含有蛋白酶抑制剂的PBS中由高浓度到低浓度依次2倍稀释， 50叱孔由排枪加到non-binding的96孔板，然后在上述缓冲液中加入适量的 DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白和 Biotin-Ahx-hCLIP 多肽，其终浓度分别为 0.1 |1M 和3 rM,混匀后以50叱孔逐孔加到同一 96孔板中，稍稍震荡混匀并离心，室 温作用48小时。以L243抗体提前一天铺ELISA板，PBST清洗后将上述96 孔板中的混合液转移至ELISA板中，37℃孵育1小时，PBST洗四次，加入2000 倍稀释的Eu-Streptavidin, 37℃孵育1小时洗板，最后加入Enhancement溶液， 室温作用5分钟后读板。

室温解刊4釉
Eu-Strcptavidin
L243 抗体 coated
37y孵育lh
待检测多肽+HLA-
DRBI *0405-hCLIPm 仇蛋白
tBiotin-hCLIE 多肽
Enhancement solution, 5min内读取荧光值；

图2.多肽竞争结合实验图解
2.2.7 HLA-DRB1*0405-hCII Pep.复合物结晶及晶体结构解析
利用坐滴蒸汽扩散法获得HLA-DRB 1*0405-hCH931 -94蛋白复合物晶 体，拿到晶体之后进行X射线衍射，收集衍射图谱，通过计算，进一步得 到该蛋白复合物的原子结构。
2.2.8 从RA病人全血中提取基因组DNA
A、试剂准备：加入4.4 ml ddH2O到装有QIAGEN蛋白酶的小瓶中，待其溶解 后分装，置于-20℃冰箱保存。在AW1和AW2缓冲液中按瓶上说明加入适量的 96-100%乙醇，轻轻混匀。
B、取15ml离心管，每管底部加入100 ^l QIAGEN蛋白酶，然后加入1ml全血， 轻轻混匀。
5加入1.2mlAL缓冲液，盖上盖子，上下翻转离心管15次，然后涡旋震荡1 分钟以充分混匀，然后置于70℃水浴10分钟。
口、加入1ml 96-100%乙醇到混合液，上下翻转离心管10次，然后涡旋震荡以 充分混匀。
E、将所有混合液轻轻转移到试剂盒提供的QIAamp Midi柱式离心管，3000 rpm 离心3分钟。
F、弃掉过滤液，加入2ml AW1缓冲液，5000 rpm离心1分钟。
6、加入2ml AW2缓冲液，5000 rpm离心15分钟。
H、将QIAamp Midi柱置于一个干净的15 ml离心管上，加入200 ddH2O,室 温静置5分钟，5000 rpm离心2分钟。
I、提取的基因组DNA取2 通过Nanodrop测浓度，取适量送北京旌准医疗 科技有限公司做HLA-DRB1基因型鉴定，剩余的DNA样品置于-20℃冰箱冻存。
2.2.9 从RA病人全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）
A、用10ml EDTA抗凝管收集HLADRB1*0405等位基因阳性的RA病人静脉 血。
B、取8 ml血液到50ml离心管，以等量PBS稀释。
C、另取50 ml离心管，在管底轻轻注入20ml Ficoll,将稀释好的血液轻轻铺在 Ficoll 上。
口、离心机升速和降速设置为0，20℃，400g离心30分钟。
E、用移液枪轻轻吸出PBMC层到一个新的50 ml离心管中，加入30 ml PBS, 400g离心10分钟。
F、弃上清，2 ml完全RPMI培养基重悬PBMC,细胞计数。按1x106个细胞/ 孔铺到96孔细胞培养板中，加入20图/ml多肽刺激，同时加入人来源的IL-2
细胞因子，将96孔细胞培养板置于37℃ 二氧化碳细胞培养箱培养7天。
2.2.10 酶联免疫吸附试验（ELISA）
A、待PBMC培养到第6天，用抗人IFN-gamma的抗体铺酶标板，100 W孔， 4℃过夜。
B、第二天，PBST洗板五次，室温封闭1h。
C、PBST清洗五次，加入标准液与培养第7天的细胞培养上清，100 口/孔，4℃ 过夜。
D、清洗五次，加入生物素标记的抗人IFN-gamma抗体，100 口/孔，室温孵育 1小时。
E、清洗五次，加入100叱孔Avdin-HRP,室温孵育30分钟。
F、清洗五次，加入100 W孔1XTMB溶液，室温孵育15分钟。
G、待标准品孔出现明显阶梯状蓝色之后加入50 W终止液。
K、10分钟之内450nm检测OD值。
L、绘制标准曲线，计算浓度。
2.2.11 统计学处理和分析
所有都实验都经过三次以上重复和证实。用Graphpad Prism 5软件作图，数 据用均值士标准差（x士 SD）表示。单因素方差分析用unpaired t-test方法；双 因素方差分析用 Two-way ANOVA 方法。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001 表明组间的差异有统计学意义。
3. 实验结果与分析
3.1 表达质粒获得成功构建
如图3A, His-tag为纯化蛋白用，Fos/Jun序列的加入能够保证a和B链形成 二聚体，TEV酶切位点的加入是为了后续切割蛋白做结晶用。hCLPmut的存在 有助于维持al和pi之间形成的Pocket的空间构象。Thrombin酶切位点的加入 是为了后续其它多肽的替换。图3B为HLA-DRB1*0405-hCLIPmut蛋白的空间 结构示意图。
(A)

(B)

图3. (A) a和p链表达序列示意图。(B) HLA-DRB1*0405-hCLIPmut及其嵌合
的多肽组成的蛋白复合物的空间结构示意图。
40

3.2 西方印迹法鉴定HLA-DRB1*0405-hCLIPmut蛋白获得成功表达

图4.西方印迹法检测蛋白表达。条带1： HL