SN∕T 3578-2013 大豆猝死综合症北美种活性检测方法(出入境检验检疫).pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3578-2013 大豆猝死综合症北美种活性检测方法Viability detecion of Fusrium virguliforme ODonnell et T. Aoki 2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 3578-2013 目。昌本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草o请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准1111叶家认111:认可监督怦理委员会捉11并川门。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、广东省微生物研究所、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:章桂明、王颖、程颖慧、陈枝楠、仲建忠、李秋枫、向才玉、代京莎、汪莹、陈洪俊。SN/T 3578-2013 大豆猝死综合症北美种活性检测方法1 范围本标准规定了应用i激且殷史光扫描共聚焦显微镜对大豆猝死综合症病菌北美种(F川川5川正t川r门Z山umvzrgulif阳()J川r川，ODo且nn冗叫eellet T. Ao咔k王i仆)的活性进行检j测贝则t的方法。本书J*适川JT大时猝死综合症病由北美种相关奇主rfr抗，liY的大。j平死综合症病菌北美种的活性检测鉴定。2 原理应用荧光染料对病原菌镰刀形分生于包子进行染色处理，根据大豆猝死综合症北美种病菌不具活性的子包子染上荧光、具有活性的于包子不染上荧光的染色效果差异的特点，运用激光扫描共聚焦显微镜对病菌子包子进行检测，分析其活性情况C3 仪器用具和试剂3. 1 仪器用具激光扫描共聚焦显微镜、显微镜、高压灭菌锅、生物安全柜、生化培养箱、冰箱C3.2 试剂腆化丙陡(PD、二甲基亚枫(DMSO)、琼脂粉。4 活性检验方法4. 1 病原菌子包子获取在显微镜下，将发现确定为大豆猝死综合症病菌北美种镰刀形分生于包子挑到灭菌水中，配制成浓度大于1个子包子/L的于包子悬浮液，镜检，备用。4.2 子包子染色取1，uL腆化丙院染料(以DMSO为溶剂，浓度为0.5mmol/L)加入200,uL f包子悬浮液中，混匀，室温下避光染色15min,16 000 g离心1min去上清液终止染色，灭菌去离子水洗涤一次，重悬，于包子浓度大于1个西子/vL。避光放置备用O4.3 激光扫描共聚焦显微镜活性检测4.3. 1 将完成染色样品制备玻片，封片，倒置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上，低倍镜下找到袍子，转到100倍油镜下观察，微调至视野内图像清晰O4.3.2 选择相应的激光管(氧离子激光器)激发荧光信号，设置荧光通道的激发波长(488nrr叶，收集荧光信号的发射波长(560nm)，并设置一个明场通道作为对照OSN/T 3578-2013 4. 3. 3 选择低像素的平面扫描方式进行粗略扫描(xy:512X512)，依据扫描成像效果中荧光信号强弱可调整探测针孔(Pinhole:1 AU，即1Airy Units二O.8 I1-t川、光电倍增管增益CGain:560)、激光扫描强度CScan Str: 5 % ) ，根1m罔像仨|噪比如l整打描模式Cline)、E复扫描次数CAverage:2)和扫描速度CSca口speed:6)。4.3.4 调整至成像质量较好时，再用精确扫描方式(工川2048X2048)获取最终图像O4.3.5 扫描至少30个于包子，观察染色情况。注:为了保证图像能够反映出于包子最真实的荧光染色情况，特别需要观察明场通道下所得J包子图像是否清晰。4.4 抱子萌发取子包子悬浮液100L，均匀涂布于水琼脂培养基上，用封口膜封口，24oc光照培养16h18 h，观察仙子萌发怕况。5 结果判断与表述结果判断与表述如下:一-j包子染色后通过激光共聚焦显微镜随机扫描至少30个于包子，所扫描的于包子中，检测到没有荧光的于包子(参见附录A中图A.1)，判定大豆猝死综合症病菌北美手中袍子具有活性;于包子染色后通过激光共聚焦显微镜随机扫描至少30个子包子，所有子包子均呈红色荧光(参见图A.2)，判定大豆猝死综合症病菌北美种子包子不具活性;激光jC堤f七日微镜扫描结果X:dt判断抱f洁性的-进行J包f萌发实验，书:!据萌发情况判定。6 样品与原始数据保存6. 1 样品保存存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月O如发现具有活性的大豆猝死综合症病菌面子的，该样品应保存1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕O保存期满后，需经灭菌处理。6.2 原始数据保存样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归挡，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。2 SN/T 3578-2013 附录A(资料性附录)大豆猝死综合症病菌北美种子包子染色结果图a) 激光通道扫描图b) 明场扫描图图A.1北美大豆猝死综合症病菌具活性的抱子染色图a) 激光通道扫描图b) 明场扫描图图A.2北美大豆猝死综合症病菌不具活性的子包子染色图已ON|区的同军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准大豆猝死综合症北美种活性检测方法SN/T 3578-2013 争夺中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:[phone]网址WWW.spc.口 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷手毛印张0.5字数8千字2013年8月第一次印刷1 16 2013年8月第一版印数1-1600开本880X 1230 7巳定价16.00争夺书号:155066 2-25767 SN/T 3578-2013