PET生物降解酶的研究进展.pdf

第 卷 第 期 年 月内 蒙 古 林 业 科 技 .收稿日期:修回日期:资助项目:内蒙古自然基金()作者简介:张馨月()女内蒙古赤峰人在读研究生从事昆虫分类学研究:.通信作者:白晓拴()男内蒙古鄂尔多斯人教授博士从事昆虫分类学研究:.生物降解酶的研究进展张馨月袁 博白晓拴(内蒙古师范大学 生命科学与技术学院内蒙古 呼和浩特)摘 要:聚对苯二甲酸乙二醇酯()作为生产量最大的塑料制品之一其对环境造成的负担逐渐加重如何处理塑料废弃物成为焦点问题 目前生物酶降解法被认为是最理想的处理方法其环保无污染的特征符合当下人们对绿色生态的追求 本文介绍了 及其主要降解酶 角质酶和 水解酶同时重点阐述了提高 水解酶降解效率的方法及改造策略并对 水解酶的发展提出展望关键词:水解酶酶促降解降解速率中图分类号:文献标识码:文章编号:()():().:塑料作为高分子材料之一得益于有机高分子技术的发展人们不断开发新的塑料产品、扩大生产规模据联合国环境规划署()的数据显示 年全球塑料年产量达到.亿 其中我国的塑料产量占比超过 居世界首位 尤其自 年新型冠状病毒感染暴发以来口罩等一次性塑料防护用品使用量激增这些人工合成的高分子聚合物在自然环境中无法被快速降解给土壤等带来严重的污染 人们将直径小于 的塑料颗粒称为微塑料微塑料通过多种途径进入人体并产生危害:据研究显示微塑料可以通过抑制乙酰胆碱酯酶活性对神经系统产生毒性作用并且在分子水平上影响细胞功能 人体内的微塑料超过一定量将引发炎症破坏免疫系统 此外微塑料中的化学物质还会导致糖尿病、癌症等发生 概述聚对苯二甲酸乙二醇酯()由对苯二甲酸()和乙二醇()脱水缩合而成的热塑性聚酯其结构式如图 自 年由杜邦实验室合成以来由于其优越的物理力学性能及热稳定性成为最常用的合成塑料之一并广泛应用于饮料包装据统计市场中约有 的饮料瓶采用了 外包装技术 数量庞大的 制品在废弃后形成了“白色污染”严重破坏了生态环境的可持续发展 因此 塑料垃圾的回收降解引起了世界的广泛关注目前针对 废弃物降解方法主要有 种:物理法、化学法和生物法 物理法即将 废弃物回收分类后进行粉碎等处理后进行二次制造或改 内 蒙 古 林 业 科 技第 卷H2H2OOCCCCOOn图 聚对苯二甲酸乙二醇酯分子式.性造粒生产纤维 该方法的缺点是有害物质残留、分子链受到破坏、黏度下降等影响 制品的质量 化学法即利用化学方法对 进行解聚解聚形成的单体或低聚物可作为原料进行再生产 目前化学法是工业降解 的主要方法包括水解法、醇解法和氨解法 种 相较物理法化学法实现了 的循环利用但降解成本高昂、降解过程中使用的化学催化剂会对环境造成二次污染因此研究人员迫切寻求更为经济环保的 降解方法在 年 等发现了几种可以水解多种聚酯的酶 随着生物工程技术不断发展人们将目光转向了生物降解 微生物首先分泌胞外酶在胞外与大分子聚合物 结合将大分子 转化为水溶性的小分子化合物并吸收至体内这些水溶性的小分子在微生物体内进一步分解最终分解为二氧化碳、水等物质(具体过程见图)相较于物理法和化学法生物法具有成本低、反应条件温和、绿色无污染等优点 因此 的生物降解已经成为热门话题之一目前已经报道了多种 降解酶研究人员对这些降解酶的结构及降解机制进行深度解析并对其进行多种工程改造以获得更为高效的降解酶实现 废弃物的无污染降解水、二氧化碳等代谢产物微生物分泌胞外水解酶水溶性小分子被吸收到微生物体内水解酶吸附到PET表面并发挥降解作用HOOOCCO CH2CH2OH水溶性小分子塑料OOOOCCCH2CH2nn图 塑料的生物降解机理.水解酶 水解酶属于 水解酶家族的羧酸酯水解酶 目前已知 水解酶有:酯酶、角质酶、脂肪酶、与 其中酯酶只能改善 膜的表面亲水性、脂肪酶因其催化中心结构域所限对 的水解活性较低 而角质酶及其同系物具有很强的 水解能力能够在高温下降解 同时 和 可在常温下高效水解 因此大多研究集中于采用角质酶与 降解.角质酶角质酶属于 水解酶超家族最早在植物及昆虫病原真菌中发现 角质酶具备羧酸酯酶和脂肪酶的部分特性但又与之不同 与脂肪酶相比角质酶不需要界面活化其催化丝氨酸可直接暴露于溶剂中有利于 的高效水解 此外角质酶可形成氧阴离子空穴该空穴位于活性位点对于稳定底物酯或酰胺羰基氧上的负电荷具有重要意义如图 所示角质酶可将 水解成对苯二甲酸乙二酯()、单羟乙基对苯二甲酸酯()、苯二甲酸()、乙二醇()等亚基 以 为例 第 期张馨月等:生物降解酶的研究进展 在角质酶的作用下酯键催化断裂形成 末端链和 末端链 末端链和 末端链继续被降解成()、()、等二聚体和单体最终降解为、和 PETTPA末端链HE末端链TfCut22-HE（MHET）2（MHET）2BHETMHETTPAEG图 角质酶 降解机制.年 等发现腐皮镰刀菌角质酶()能够对 纤维的表面进行改性并将 分解为 和 且实验结果表明 的最佳反应温度应低于 达到 时失活 等发现在 的条件下 能够将 低结晶度的 膜完全分解成 和 单体 同时在 年 等还发现了一种来源于特异腐质霉()的 角质酶能够降解低结晶度的 具有良好的热稳定性可在 下反应 此外研究人员还从多种褐色喜热裂孢菌()菌株中发现了、和 等角质酶 可在 下降解 结晶度的 膜三周后 膜的重量减少了 这是对 降解 的首次报道 等通过在 中添加大量的、使得在 下 膜的质量减少、的添加将酶的活性提高了.倍 等发现了两个来自嗜热纤维菌 的角质酶 和 二者紧密相关且均具有水解 的能力 等在绿色糖单胞菌 病毒体中获得了 该酶的活性及热稳定性与之前发现的角质酶相比均有所提高 年 等克隆出了堆肥宏基因组的 在 值为.的条件下水解 显示出 的酶活性 以上提到的角质酶均具有较高的热稳定性温度范围可达 而在 值范围绝大多数的角质酶适应于中性或碱性 值环境 例如真菌角质酶的最佳 值为.和 年 等筛选出了一种新的菌株大阪堺菌()该菌株以 为唯一碳源 在此之前人们普遍认为只有脂肪酶、酯酶等能够水解酯键分解 数量稀少活性较低该菌株利用水解酶 在 的反应条件下与.的 膜反应 周后低结晶度的 膜完全分解为小片段 单(羟乙基)、此外研究人员还发现了一种 水解酶()该酶与 协同反应将分解的 进一步水解最终转化为 和(图)OOOOOOOnH2OH2OHOOHHOOHHOOOOHPETaseMHETase（PET）（MHET）（TPA）（EG）图 中关键 降解酶的反应.一种来自细菌 的(即一种降解 的酶被称作)属于 水解酶超家族 水解酶根据构成氧阴离子孔的氨基酸可以分为 型、型和 型等 降解酶均为 型 经过进一步研究发现 由 个氨基酸残基组成具有典型的 水解酶折叠方式 该酶具有独特的延长环以增强酶与 的结合 等发现 与角质酶具有 的氨基酸序列相似性因此他们认为 是角质酶的同源物 与角质酶相比 具有更宽的活性位点有利于 大分子进入催化中心 在活性位点处发现了 的保守催化三联体 丝氨酸残基位阻较小能够产生更宽的口袋以供 底物的结合而角质酶中则为苯丙氨酸残基位阻较大 这些结构均使得 对 具有特异性的降解 在活性位点具有两个二硫键(角质酶只含有一个二硫键)特殊的二硫键 能够连接 特有的一段 区特殊的二硫键结构使得 适于在中温下水解 数据表明 下的水解活性较其他水解酶高.倍 相对角质酶等需要在高温下才能水解 表现出了更高的优势并为生物降解 提供了更多的可能性 内 蒙 古 林 业 科 技第 卷与其他 水解酶相比除上述所提到的特异性降解 外 还表现出了以下特征:()水解活性与酶浓度影响呈负相关酶浓度较高时水解活性反而出现降低现象()降解效率高 还能够降解高结晶度 膜降解效率是其他 水解酶的.倍 提高 水解酶效率的方法生物降解 法相对其他处理方法表现出了极高的优势以及广阔前景其污染性低的特点也符合当下人们对绿色环保的追求这项研究正受到越来越多的关注 然而 生物降解技术仍存在许多问题水解酶由于其热稳定性及水解活性等限制无法进行大规模的工业化应用如何有效提高 水解酶的降解速率成为科学家们思考的问题在 年发表于的一篇文章中提到:来自法国图卢兹南部比利牛斯联合大学的研究团队提出了一种新的可在 分解 的 角质酶 该团队在评估验证后选择了 和 两个最佳突变体在 和 内分别达到 和 的转化率进一步借助计算机进行辅助后可在 内达到 的 分解率 近期 等利用弹性蛋白样多肽()标记角质酶标记后的角质酶相对野生型角质酶活性和热稳定性等均有所提高有效解决了酶降解 过程中产物抑制的问题但产量不足需要进一步研究.酶的定向进化定向进化是提高酶性能的有效方法之一高通测量筛选技术可作为定向进化应用的主要手段 可特异性地降解 是一种极具潜力的 水解酶 等基于一种新的高通量荧光筛选技术获得了高性能突变体 可完全降解 结晶度的 材料而对于高结晶度的 材料需先对材料进行处理将结晶度降低至 以下再进行解聚近期 等利用基于双荧光的高通量筛选方法对 进行突变体筛选获得了 个高效 突变体其活性提高了.倍 该实验的高通量筛选方法经证实具备广泛的 材料适用性且方便快捷在 内能够完成 个突变体的筛选因此对 降解的研究提供了新的数据参考有助于优化 塑料的降解方案.基于未培养微生物的可培养化提高 水解酶效率生物降解法限制之一在于目前能够分泌降解 酶的微生物数量极低且酶分泌量不足因此需要进一步发掘更多的 水解酶与微生物并加大其产量以扩大 回收水解的工业化应用 然而人类对微生物的了解仍是狭隘的在自然界中有 多种的微生物基因组中存在着高达 种有关塑料降解的酶基因其中 降解酶相关同源基因有 种但目前仅有 余种微生物被鉴定出可降解 大部分都来源于未培养微生物这些未培养微生物中可能存在高塑料降解能力的微生物类群 等利用高通测量技术测定了未培养微生物宏基因组并筛选出能够降解 的 角质酶基因 等将塑料进行长期人工培养获得了一个具有 降解能力的微生物菌群 对未培养微生物进行人工培养也是提高 降解酶产量的有效方法之一 此外研究人员利用原位培养装置模拟微生物的原生环境成功培养出数种未培养微生物 等设计了一种新的原位培养装置将培养体系与外界环境以半透膜的形式隔离成功解决了未培养微生物的 状态(活而不可培养态)获得了未培养微生物的纯菌株 原位培养装置还能对微生物的群体感应机制()进行最大程度的模拟利用微生物的成膜性极大提高了未培养微生物降解 的能力 综上未培养微生物的可培养化策略在 生物降解方面表现出了广阔的前景.提高 水解酶热稳定性与水解活性由于 材料自身需要在高温下才能够进行玻璃性转化因此反应过程中需要水解酶具有较高的热稳定性 研究人员曾在水解酶中添加二价金属离子(、等)增加稳定性 然而 在反应过程中可能会和其他物质产生不溶性副产物因此在工业中不能依赖 进行大规模降解 研究人员在此基础上提出可利用二硫键对 结合位点进行替代之前的研究表明二硫键对于蛋白酶的热稳定性具有重要意义 等对 酶进行改造引入二硫桥或盐桥使得 突变体在.下有效降解 薄膜 等对 改造获得了 双突变体在.下反应 催化活性提高了.倍 该突变体的(熔解温度)比野生型的提高了.等依据静电相互作用提高 热稳定性通过实验发现突变体 水解活性提高.倍并显示出.的最高 值 等在 的基础上添加了一对二硫键设计出了 突变体增强了 的整体刚性提出增加关键区域的柔性可在一定程度提高 降解的能力 同时研究人员还通过蛋白质表面静电荷优化来提高 的热稳定性使得该突变体可降解.的无定型 粉末和.的 预成膜速率分别提高了.倍和.倍 该实验进一步提高了 在 降解方面的潜力与应用 第 期张馨月等:生物降解酶的研究进展 .基于计算机技术提高 水解酶活性除了上述基于酶结构的改造外计算机技术也被用于 降解酶的热稳定改造 目前已有多种基于计算的蛋白质工程改造方法 目前开发的混合策略可显著扩大预测突变体的数量增加了更多的组合途径 贪婪算法目前在人工智能中的应用愈加广泛 等以该算法为基础引入了蛋白质工程的贪婪积累策略()该策略可最大化地利用突变集之间的可加性和(或)协同作用来探索上位性效应 研究人员基于蛋白质工程的贪婪积累策略对 进行改造利用融合策略预测了 个有益单点并进行检验将得到的 个有益单点分为 个依据贪婪算法将 进行 轮迭代增加获得了具有 个氨基酸突变的 突变体该突变体的 值较野生型增加 对 的高结晶度 的水解活性提升了.倍 总结与展望截至目前已发现的角质酶等水解酶能够有效降解 但这些水解酶法同时也存在着许多不足 水解酶 对底物具有专一性并且所需反应温度较低但对降解 具有较高的潜力可对该水解酶做进一步的研究 而蛋白质工程可针对酶的基因组进行增强改进因此可利用蛋白质工程对 水解酶进行工程改造以提高其降解效率 此外随着高通量技术的发展该技术可用于对酶进行定向进化以及筛选目前已经有诸多科学家通过该手段筛选了新的未培养微生物产生的水解酶并思考这些未培养微生物的可培养化方案 此外研究人员还通过高通量技术获得更为有效的水解酶突变体提高了水解酶的活性及热稳定性这可能成为更有效的手段之一 计算机技术的进步可在另一方向上辅助科学家进行探索研究人员或许应该更多地思考计算机对酶的预测筛选以期更快地解决 降解难题总之 生物降解法将成为 乃至其他塑料制品降解的最有效手段之一需要人们进行更多的研究来发掘这些酶的潜能为塑料污染的彻底降解以及创造绿色的生态未来提供理论基础和研究方案参考文献:杨小飞 钱立 王向阳.联合国决议“终止塑料污染”.生态经济 ():.:.:.:.:.贾运普 邢建民.聚对苯二甲酸乙二醇酯()的生物降解与产物再造研究进展.生物加工过程 ():.().():.邢科.包装废弃 塑料的降解及降解产物性能研究.西安:西安理工大学.石开宇 郭立颖 王逸蓉 等.降解方法及离子液体催化剂的研究进展.塑料 ():.:.():.().():.():.()().():.():.李秀.新型 水解酶的结构研究与分子改造.天津:天津大学.():.赵彧瑾 陈仔君 赵晶晶 等.聚对苯二甲酸乙二醇酯()降解酶的研究进展.微生物学杂志 ():.().():.:():.().():.():.():.内 蒙 古 林 业 科 技第 卷 .():.():.():.():.().():.().():.().():.().:.李志帅 高健 陈纯琪 等.聚对苯二甲酸乙二醇酯()塑料水解酶结构、功能及改造.生物加工过程 ():.:.:():.:.():.刘欣悦 崔颖璐.塑料废弃物及微塑料生物降解与转化的研究现状与展望.生物加工过程 ():.().():.:.()().:.李秀 杨海涛 王泽方.聚对苯二甲酸乙二醇酯降解酶的研究进展.微生物学报 ():.():.:.():.().():.():.():.().:.李常清 赵凌燕 李奇昊 等.浅谈聚对苯二甲酸乙二醇酯的生物降解技术.山东化工 ():.“”.():.():.():.():.:.().:.:.():.:.():.