兔脂肪组织来源干细胞体外生长特性及培养的适宜条件.docx

摘　　要
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背景：脂肪组织来源干细胞是位于脂肪基质内的一种细胞,具有多向分化潜能,可以定向分化成多种细胞类型。目的：探索兔脂肪组织来源干细胞体外生长特性及胶原酶消化适宜条件。设计、时间及地点：细胞分子生物学实验,2008-05/09在解放军南京军区福州总医院比较医学科及实验科完成。材料：日本大耳白兔5只。Ⅰ型胶原酶为美国Worthington公司产品,低糖DMEM/F12培养液为美国Gibco公司产品。方法：兔颈后部皮下脂肪取材,采用Ⅰ胶原酶消化法获取细胞,按Ⅰ型胶原酶消化质量浓度分为1.0,1.5,2.0g/L3组,每组再按消化时间分为0.5,1,1.5h3个亚组。脂肪组织剪碎混匀后均分为9等分,最后重悬细胞终体积均定为2mL并计数,每个亚组计数6次,共取5次脂肪组织,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞。主要观察指标：细胞体外生长特性并比较不同胶原酶浓度、胶原酶消化时间对兔脂肪来源干细胞体外培养的影响。结果：采用1.0,1.5,2.0g/L三种不同胶原酶浓度进行消化,发现在消化时间为0.5h和1h时,2.0g/L组消化细胞总数最多,细胞总数与其他组比较,差异有显著性意义（P〈0.01）。在消化时间为1.5h时,消化细胞总数较0.5h和1h均有增加,同时,1.0,1.5,2.0g/L组消化细胞总数无统计学差异,活细胞比值1.0g/L组最高,但与其他组无统计学差异,观察第3代细胞生长特性,1.0g/L消化1.5h组别具有更好的增殖活性。结论：脂肪来源干细胞具有较强的自我更新能力,对于兔脂肪组织来源干细胞,胶原酶浓度1.0g/L、消化时间1.5h是最佳的获取条件。

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不同冻存时间与温度对兔骨髓基质干细胞存活率的影响

摘　　要:
目的：以二甲基亚砜作为保护剂，采用慢冻快融法观察不同温度及不同时间冻存的免骨髓基质干细胞复苏后存活率的变化。方法：实验于2003-09／2005—06在浙江省医学科学院生物工程所完成。①选取清洁级3月龄新西兰大白兔5只，抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出兔骨髓基质干细胞，并进行增殖。②取第3代骨髓基质干细胞，经消化后离心重悬，用完全培养液调整细胞浓度为6×10^9L^-1。将质量浓度为250g／L的二甲基亚砜缓慢滴入同体积含骨髓基质干细胞的上述培养液中，混匀，二甲基亚砜的终浓度为125g／L，骨髓基质干细胞的终密度为3×10^9 L^-1，1mL／安瓿冻存。③4℃冻存直接将安瓿置4℃冰箱中；-20℃及-60℃冻存，则将安瓿置于有脱脂棉的聚丙烯泡沫盒中，壁厚1．5cm，扎紧密封，各置-20℃及-60℃冰箱过夜，取出后分别直接放于-20℃及—60℃冰箱保存；-196℃液氮冻存，则将置有安瓿的泡沫盒于-60℃冰箱过夜后，取出冻存安瓿直接放于液氮中保存。骨髓基质干细胞分别于4℃、-20℃、-60℃、-196℃条件下进行3d，10d，1，3，8个月以及1年的冻存。④经不同温度及不同时间冻存后，给予复苏。复苏时将冻存安瓿从液氮或冰箱中取出，立即置37℃水浴并轻轻摇动，约1min迅速解冻。含骨髓基质干细胞的冻存液经5倍于冻存液量的完全培养液稀释后，离心重悬，进行骨髓基质干细胞存活率测定。复苏后的骨髓基质干细胞以1×10^4／cm^2用完全培养液再培养，观察骨髓基质干细胞的形态变化及生长活性情况。结果：实验选取3月龄新西兰大白兔5只，全部进入结果分析。①兔骨髓基质干细胞原代培养情况：培养3d时，骨髓基质干细胞数量较少，散在分布，呈短梭形形态。培养1周时细胞形成大量的小集落细胞变长。此后集落细胞迅速增多，逐渐汇合成片，形态为均一的长梭形，呈旋涡状排列，2周时细胞长成单层。②兔骨髓基质干细胞传代培养情况：刚传代的骨髓基质干细胞呈圆形，数小时后迅速贴壁，重新成为梭形。之后细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养更均一，细胞生长旺盛、增殖迅速。连续传代22代无明显变化。但随传代次数增多，细胞形态出现多样性，逐渐呈老化现象。③不同温度不同冻存时间下复苏后的兔骨髓基质干细胞存活率的比较：兔骨髓基质干细胞液氮保存1年，存活率为79％；-60℃保存1，3，8个月的存活率分别为67％，38％和0％；不宜于4℃及-20℃保存。（少复苏后的骨髓基质干细胞再培养情况：复苏后的骨髓基质干细胞细胞形态及生长状况与冻存前无明显差异，呈长梭形生长，增殖旺盛。结论：分离纯化的兔骨髓基质干细胞生长增殖能力强，短期保存可用-60℃冻存，长期需液氮保存，为择期进行骨髓基质干细胞实验和应用提供实验依据。

兔脂肪干细胞的体外分离培养特性
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唐少锋[1,2] 刘承杏[3] 姬林松[1] 马涛[1] 李世和[1]
[1]昆明医学院第一附属医院骨科,云南省昆明市650032 [2]解放军成都军区昆明总医院脊髓损伤治疗科,云南省昆明市650032 [3]昆明医学院解剖教研室,云南省昆明市650031

《中国组织工程研究与临床康复》
2009年第13卷第10期
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摘　　要:
背景：现有国内外文献报道的脂肪干细胞分离、培养方法并不完全一致,所应用的消化酶、消化方法、培养基等均存在差异。目的：观察体外分离培养的兔脂肪干细胞生物学特性。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-04/2008-03在昆明医学院生物医学中心干细胞所完成。材料：健康成年新西兰大白兔6只,由昆明医学院实验动物中心提供。Ⅰ型胶原酶为美国Gibco公司产品,胰蛋白酶为美国Sigma公司产品。方法：无菌切取兔腹股沟皮下脂肪垫,采用Ⅰ型胶原酶搅拌消化法分离培养原代脂肪干细胞,待细胞生长至80%融合时传代。主要观察指标：倒置显微镜和苏木精-伊红染色观察细胞形态及生长情况,免疫荧光细胞化学染色检测细胞表面抗原的表达,MTT比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞增殖指数。结果：自兔皮下脂肪分离培养获得的脂肪干细胞增殖迅速,低密度生长时呈三角形或短梭形,核/浆比例较大,接近融合时呈成纤维细胞样外观,长期传代形态无明显改变。第3代脂肪干细胞表面抗原CD44呈阳性表达,CD34为阴性;细胞生长曲线呈“S”形,在对数生长期其细胞倍增时间为59h。随传代次数的增加,来自同一供体的兔源性脂肪干细胞增殖指数逐渐升高,至第8代达到最高,以后逐渐降低。结论：兔皮下脂肪组织中含有丰富的间充质干细胞,兔源性脂肪干细胞体外以成纤维细胞样形态贴壁生长,表达CD44表面标志物,具有较强的体外增殖能力