[学术报道]微生物法在维生素分析中的应用.doc

中国疾病预防与控制中心 营养与食品安全所 石 磊

　　微生物法最根本的原理在于利用了微生物对于某些营养物质的特异性。大量的研究发现，某种微生物会对某种维生素具有极强的特异性，是其正常生长所必需的维生素，并且在一定条件下，其生长与繁殖速度与溶液中该维生素的含量成一定的对应关系，含量高则生长快，反之则慢，微生物法便利用了这种对应关系间接地测定出样品中该维生素的含量。

　　一般来说，可以采用比色、比浊、滴定的方法进行测定。

　　微生物分析法的发展和微生物学、生物化学、营养学以及食品科学的发展密不可分。1889年，Beijerinck首次发现酵母菌的生长与其生长环境中的某些营养成分存在一定对应关系， Williams于1897年首次提出利用微生物测定维生素的构想，从此，微生物分析方法便逐渐的发展起来。 20世纪20年代到40年代，是微生物分析方法迅猛发展的时期。在此期间，1939年，Snell 和Strong 采用乳酸杆菌成功的测定了食物中的核黄素，Kuiken和他的同事Wood于1943年建立氨基酸的微生物分析法。50年代后，微生物分析方法进入了鼎盛时期，许多维生素的微生物测定方法相继建立，并广泛地应用于食物、药剂以及饲料等各类样品的分析测定，如维生素B6、维生素B12、尼克酸、泛酸、生物素、胆碱、叶酸、肌醇等，这种状况一直持续到80年代后期。

　　一、 微生物分析方法的应用现状

　　进入90年代以来，随着分析技术的不断发展，分析方法逐渐朝着高效、快捷、简便的方向发展，由于微生物法固有的许多弊端，因此微生物方法已有被仪器分析方法所取代的趋势。以英国食物成分数据库为例，在1974年版的食物成分数据库中，维生素B1、维生素B2、尼克酸和维生素B6的分析方法为微生物法，而在1984-1989年期间，这些维生素的分析方法均被替换为HPLC法或。

　　1．微生物仍旧是维生素分析的重要手段 
　　由于微生物分析方法的经典性，准确可靠性以及广泛适用性，所以许多国际标准方法机构仍旧将微生物法作为部分维生素分析的标准方法或第一方法。在最新的第17版AOAC（Association of Official Analytical Chemists）分析方法中，食物中生物素、泛酸、叶酸、维生素B6、维生素B12、尼克酸的第一分析方法均为微生物法，维生素B1和B2的第二分析法为微生物法。在AACC(American Association of Cereal Chemists)审批方法中，叶酸、维生素B6、维生素B12、尼克酸的标准分析方法均为微生物法。 
　　目前，即使在许多发达国家的食物成分数据库中，微生物法仍旧是维生素分析的一个重要手段。表1列出了美国、英国、新西兰以及我国的食物成分数据库中采用微生物法分析维生素的情况。

表1 微生物法在不同国家食物成分数据库中的应用情况

 维生素种类
比例 
美国 
 叶酸、生物素、泛酸、维生素B12
 20%（20种维生素）
 英国
 叶酸、生物素、泛酸、维生素B12
  30.8%（13种维生素）
 新西兰
 叶酸、维生素B12
 29%（7种维生素）
 中国
 叶酸、生物素、泛酸、维生素B12、维生素B6、尼克酸
 42.8%（共14种维生素）

　　从表1中可看出，对于异构体较多或食物中含量较低的维生素，大部分国家采用微生物法，而对于一些形式单一或自然界含量较高的维生素均采用了化学法或仪器分析法，比如维生素B1、B2、尼克酸等。

　　2．不同类样品中维生素分析方法的多元化 
　　随着分析理论和技术的快速发展，分析方法也逐渐走向多元化。生物样品、药剂、婴儿配方食品中的部分维生素分析由原来的微生物法逐渐转变为HPLC法或其它分析法。

　　表2 不同样品中同一维生素的常用分析方法

　　生物样品 药剂 婴幼儿配方食品 天然食物 
　　生物素 HPLC, HPLC HPLC 微生物法 
　　泛酸 微生物法 
　　叶酸 微生物法 
　　维生素B12 微生物法 
　　尼克酸 微生物法

　　由于食物样品的组成成分远比其他类样品复杂，并且大部分维生素以结合态存在于其中，在使用仪器法测定时，通常会由于干扰物多而降低了方法的灵敏度。表2的数据提示，目前使用微生物法最多的样品仍旧是天然食物样品，而其它形式样品中维生素的分析方法均已被HPLC法或其它方法所替代。

　　二、 当前应用微生物法的优势及存在问题

　　1． 微生物法的优势 
　　微生物法沿用至今已有近50年的历史，这也归功于其无法替代的优势，主要有以下几方面：

　　l 具有极高的灵敏度; 
　　由于微生物最根本的是利用了微生物对于营养素的敏感性来测定，而生物体的敏感性是其他任何仪器都无法替代的，所以微生物法的灵敏度比其他仪器法、化学法都要高。 
　　从表3可发现，采用ATCC7830测定维生素B12时，该方法的灵敏度仅为0.001ng/ml，这也是当前大部分国家采用微生物法测定食物中维生素B12的原因所在，因为食物中的维生素B12含量很低，一般在2-10μg/100g之间，现有的仪器方法无法测定如此微量的维生素含量。微生物法的高灵敏度是其广泛地应用于食物中维生素含量测定的主要原因之一。

　　表3 部分维生素微生物分析法的灵敏度范围 
　　维生素 选用微生物种类 灵敏度范围（ng/ml） 
　　VB1 ATCC 12706 0.2-10 
　　VB2 ATCC 7649 5-200 
　　尼克酸 ATCC 8014 0.5-2.0 
　　VB6 ATCC 9080 0.1-10 
　　叶酸 ATCC 7469 0.5-5 
　　VB12 ATCC 7830 0.001-0.1

　　l 准确度高 
　　近50年来，微生物法被广泛地纳入各类标准方法中，如AOAC，AACC，GB以及其他国家的标准方法。以AOAC为例，每种微生物方法的建立，都需要经过全球20家以上的实验室进行方法验证，因此微生物法准确性是被广泛公认的。

　　l 先期投入少，见效快 
　　该方法的先期投入少，当实验室具备超净台、培养箱、分光光度计、医用灭菌器和一些实验室常用玻璃器皿即可开展微生物法，不需要大量额外的人力和物力，适于在任何水平的实验室快速建立。

　　l 微生物法的测定结果反映了样品中具有生物活性的被测物含量。 
　　由于微生物法是通过观察微生物的生长繁殖速度来间接测定维生素的含量，并且微生物本身就是一种生物体，所以采用微生物法测定出的维生素均是能够被生物体所利用的。例如，在测定螺旋藻中的维生素B12时，微生物法的测定结果远小于其它方法的测定结果，Herbert 等人的研究证明，虽然螺旋藻含有丰富的维生素B12，但不具有生物活性，在人体内不能发挥其应有的生理作用。 可见，微生物法的测定结果反映了具有生物活性的维生素含量。 
　　通常来说，当实验室目前尚没有准确可靠的其他方法，如维生素B12、叶酸、生物素、泛酸等；或者为了大量降低分析实验的费用；或者为了快速建立分析方法，获得数据或者为了最大限度的利用实验室有限的空间时，

　　2． 存在问题 
　　虽然`微生物具有以上优势，但它仍旧逐渐被其他方法所取代，这是由于它固有的一些致命的缺点，主要包括以下几点：

　　l 分析周期长 
　　一般在4-6天，而其它方法（HPLC法）一般在1-2天内即可完成。

　　l 实验步骤烦琐 
　　通常来说，微生物法要包括样品前处理、菌种液的制备、测试管的制备、接种、测定、计算等步骤，与仪器分析方法相比，步骤繁多。 
　　以上两点与目前分析方法简便、快速、高效的发展方向不符，这也正是微生物逐渐被其他方法替代的主要原因。

　　l 只能反映维生素的总含量，不能测定维生素各种异构体的组成和含量。 
　　随着营养学的不断发展，大量研究发现，维生素常具有多种异构体，每异构体的活性并不相同，如生物素在自然界共有8种异构体，但其中只有一种具有较高活性，如果采用微生物法则不能分离并测定出该种异构体的含量，而HPLC法则可以作到。

　　三、 我们应采取的措施

　　1． 客观地看待微生物法 
　　虽然微生物法不能代表先进性，但其准确性和广泛适用性仍旧不容忽视，因此，不要一味地追求先进性而忽视了结果的准确性和可靠性。笔者认为，当对新方法的准确性和可靠性没有完全把握时，不要轻易替代原有的微生物法。 
　　由于微生物法比较烦琐耗时，所以尽量减少微生物方法的使用。一般来说，对于成分单一、浓度较高的样品可以采用HPLC法进行测定；而对于天然食物，由于维生素含量少并且干扰物多，可采用微生物法进行测定。例如，大部分强化食品（如膳食补充剂，婴幼儿配方食品等）中的维生素B6均以盐酸吡哆醇的形式添加，当溶于水后以游离形式存在，所以这类样品可以采用HPLC法进行分析，但天然食物中的维生素B6以吡哆醇、吡哆醛、吡哆酸三种形式存在，化学法或HPLC法无法同时测定多种异构体，因此微生物法是最佳选择。 
　　总之，对于不同样品可以采用不同的分析方法，天然食物样品采用微生物法，而各类强化食品可依据具体情况采用其它化学法或HPLC法进行分析。

　　2． 不断改良现有的微生物法 
　　在尚没有良好替代方法时，可不断对现有微生物法进行改良，简化实验步骤，缩短实验周期。就我国目前实验水平来开，微生物法仍旧需要沿用一段时间，特别是一些基层实验室，因此，改良现有微生物是一个切实可行措施，其中培养基国产化和琼脂碟又是两较好的改良途径。

　　l 固体培养基的国产化， 
　　微生物法之所以烦琐的原因之一就是试剂繁多，配置复杂，而使用固体培养基则省去的试剂的配置，所以可大大降低工作量，缩短实验周期，简化实验步骤。当前，由于进口固体培养基（Difco 公司）的价格昂高，供货没有保证，所以许多国内实验室仍旧自制培养基，但由国内部分试剂的质量问题，有时也会影响到实验结果的准确性。如固体培养基实现国产化，则可大幅度简化微生物法的操作步骤，节省人力和物力。

　　l Agar Plate 
　　近几年，有不少报道采用琼脂碟代替常规微生物测定法，二者的原理相同，只是前者通过观察菌落的大小来间接测定样品中的被测物含量，它在一定程度上简化实验步骤、缩短测定时间。

　　3． 积极进行新方法的研究和建立 
　　为了适应今后分析方法的发展和要求，每个实验室在使用微生物法的同时也要积极寻找适宜的替代方法，但要注意加强新方法和原由微生物方法的比对，确保以往数据和今后数据的可比性。 
　　微生物法广泛应用于维生素的测定已有50多年的历史，但由于其实验周期长，实验步骤烦琐等弊端，终究会被仪器方法或其他方法所替代。