吸入及食物过敏原.doc

作业指导书 编号：DF-JYK-MY-SOP-021 标题：特异性过敏原试验的标准操作规程

吸入性及食物性过敏原特异性IgE 抗体检测试剂盒的标准操作规程

1 目的：保证特异性IgE(sIgE)试验的正确操作，保证检验结果的准确可靠。
2 适用范围：临床免疫实验室
3 项目名称：吸入性及食物性过敏原特异性IgE 抗体检测试剂盒
4 项目方法：欧蒙印迹法
5．原理：采用免疫印迹法原理。
5．1 经缓冲液预处理的检测膜条与患者样本进行温育。如果样本阳性，IgE 类特异性抗体与相应的过敏原结合。
5．2 在洗涤之后，加入酶标单克隆的抗人IgE 抗体（酶结合物）进行第二步温育，以形成复合物。
5．3 在孵育之后，冲洗掉未结合的酶-抗-IgE，然后加入底物液，发生颜色反应。
5．4 终止反应之后，风干判读结果。
6．标本种类及收集、运送要求：
6．1 病人准备：要求患者在安静状态下；晨起的精神、体力、情绪等因素的影响较小，是标本采集的最佳时间；抽取肘部静脉血或毛细血管血。
6．2 标本种类：人血清或者EDTA、肝素或柠檬酸抗凝血浆。
6．3 标本稳定性：待测样本于2-8°C 条件下通常可保存14 天。稀释后的样本应在同一个工作日内检测。
6．4 标本稀释：患者样本不需稀释，直接检测。
6．5 标本容器：一般用真空采血管中的血清促凝管（红色头盖）或抗凝管（紫色或绿色头盖）。
6．6 标本最小用量：血清最小用量 1ml。
6．7 标本运送：标本采集于真空采血管后应尽快送实验室分析，物流系统可加快标本传递速度。若标本不能及时转运到实验室，应将真空采血管内的标本置冰瓶或冷藏箱内，运送过程中应避免剧烈震荡。当天无法运送的标本应分离血清后冷藏。
7．试剂：
7．1 来源：欧蒙公司.
7．2 规格： 16*1人份/盒
7. 3 试剂盒组成和代号：
主要组分：16 人份的试剂盒
成分
规格
标识
包被过敏原的检测膜条：ts20, w1, w6, ds1, h1, e1, e2, i6,
ms1, u80, f1, f2, f13, f14, f27, f88, fs33, fs34, f24, f23, CCD
16x1

STRIPS
酶结合物：碱性磷酸酶标记的抗人IgE（小鼠），直接使用
1x20ml
CONJUGATE
通用缓冲液：10 倍浓缩
1x100ml
BUFFER 10x
色原/底物液：NBT/BCIP(四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-3-吲
哚-磷酸盐)，直接使用
1x30 ml
SUBSTRATE
温育盘
2 x 8 槽
TRAY
塑料封膜
1 张

产品说明书
1 份

7．4 储存和稳定性：2-8°C 保存，不要冰冻。未开封前，试剂盒可稳定至所标示的有效期。已稀释的缓冲液必须在一个工作日内用完。
7．5 试剂的准备和稳定性：
7．5．1 试剂在使用前均应在室温（18-25℃）平衡30分钟左右。
7．5．2包被过敏原的检测膜条：直接使用。为防止膜条发生冷凝，只有当膜条平衡到室温后才可打开包装。取出膜条后应立即密封好原包装并将其保存于2-8°C。
7．5．3酶结合物：直接使用。使用前充分混匀。通用缓冲液：10 倍浓缩。在稀释前应充分混匀。用干净的吸管从瓶中吸取需要量用蒸馏水或去离子水1:10 稀释。由于欧蒙印迹法中使用了特殊的膜条，因而需要用已稀释的通用缓冲液稀释患者样本和清洗检测膜条。如需温育一条检测膜条，可取5ml 浓缩缓冲液用45ml 蒸馏水或去离子水稀释。稀释后的缓冲液应在同一个工作日用完。
7．5．4底物液：直接使用，因对光敏感，使用后应立即盖紧瓶盖。
7．6 注意事项：
7. 6. 1 本检测试剂仅用于体外诊断。
7. 6. 2 试剂盒中部分试剂含有毒性的叠氮钠，应避免接触皮肤。
7．7 废物处理：病人样本，质控血清和温育过的膜条必须作为潜在传染源处理，其余试剂如果没有特殊官方规定不需要单独处理。
7．8 生物安全级别：按Ⅱ级执行。
8．其它辅助用品： Tip 、判读软件Eurolinescan。
9．使用仪器：EUROBLOTMASTER全自动蛋白印迹仪。
10.操作步骤：
仪器操作按《全自动蛋白印迹仪操作标准化规程》进行，只需分离血清上机、加样，包含温育、洗涤等各项操作均由仪器自动进行。
11．质控品的使用水平和频率：
质控品：每根膜条上均包含质控品，每个病人每次试验均有质控。
12．参考区间：
<0.35 kUA/l
13．报告结果：
13．1 标本检测结果手工输入中文电脑，数据经操作者初次审核，经小组负责人或中级职称以上的授权代理人再次审核后发出。
13．2 报告样式：欧蒙特异性IgE单位（kUA/l）

欧蒙特异性IgE用于测定特异性IgE抗体，测定值以kU/l为单位。≥0.35kU/l的值代表特异性过敏原抗体的相对浓度累进增加。<0.35kU/l的结果表明无或未检测到特异性过敏原抗体的含量。特异性IgE分级如下：
类别 浓度[ kU/l] 结果
0 <0.35 kU/l 未检出特异性抗体。
1 0.35 kU/l -0.7 kU/l 特异性抗体滴度很低，通常没有临床症状，但比较敏感。
2 0.7 kU/l-3.5 kU/l 特异性抗体滴度低，具敏感性，如果浓度在该类别的上限，则通常有临床症状。
3 3.5 kU/l-17.5 kU/l 特异性抗体滴度显著，通常出现临床症状。
4 17.5 kU/l-50 kU/l 特异性抗体滴度高，几乎总是出现临床症状。
5 50 kU/l-100 kU/l 特异性抗体滴度很高。
6 > 100 kU/l 特异性抗体滴度很高。

膜条上包被抗原位置：

位置
缩写
过敏原
1
ts20
树组合 2（柳树/杨树/榆树）
2
w1
普通豚草
3
w6
艾蒿
4
ds1
尘螨组合 1（屋尘螨/粉尘螨）
5
h1
屋尘
6
e1
猫毛
7
e2
狗上皮
8
i6
蟑螂
9
ms1
霉菌组合 1（点青霉 /分枝孢霉 /烟曲霉 /交链孢霉）
10
u80
律草
11
f1
鸡蛋白
12
f2
牛奶
13
f13
花生
14
f14
黄豆
15
f27
牛肉
16
f88
羊肉/羊羔肉
17
fs33
海鱼组合 1（鳕鱼/龙虾/扇贝）
18
fs34
淡水鱼组合 1（鲑鱼/鲈鱼/鲤鱼）
19
f24
虾/对虾
20
f23
蟹
21
CCD
CCD标记物
a
lnd
指示带

14. 临床意义：
14．1过敏反应是一种对异物的超敏反应。这些异物通常无害，但在过敏反应患者中，则产生强烈的反应。最常见的过敏反应为I 型过敏反应，其特征是形成特异性IgE 抗体。一旦跟过敏原接触很快就会产生诸如发红，水肿以及瘙痒等症状。典型的过敏反应有鼻炎、通常所说的花粉热、结膜炎和哮喘。接触过敏原的次数越多，过敏反应就会越严重。如果发生系统性过敏反应，可能会出现危及生命的严重反应（全身性过敏反应）。吸入性过敏反应可由季节性过敏原(树、草或种子的花粉)引起，也可由常年性过敏原（ 尘螨、霉菌孢子、宠物的唾液和皮屑） 引起。除了空气传播的过敏原（如花粉、灰尘和霉菌）可引起过敏反应外，还有食物也可引起过敏反应。
14. 2 最常见的食物过敏原有花生、大豆、小麦、贝类、鱼、牛奶、蛋类和坚果。食物过敏反应是IgE 介导的过敏反应，在摄入食物后的几个小时内可出现相应的症状。可能的症状为唇、舌、喉部灼痛或瘙痒、恶心、腹部痉挛、腹泻和红斑，甚至可出现哮喘、气短、心跳加速、恐慌和精神错乱。有时坚果、贝类、鱼和花生甚至能引起全身型过敏性反应或者致死性过敏反应。由于保守的植物性过敏原引发的IgE 抗体和相关植物制作的食物或者非食物类过敏原发生交叉反应。如对于白桦树花粉过敏的患者可能对苹果、胡萝卜、芹菜、榛果、马铃薯或者猕猴桃过敏。许多过敏原是含有低聚糖侧链的糖蛋白类，这些侧链结合在过敏原的蛋白骨架上。有时，患者体内会产生针对这种糖类结构的抗体。
14. 3 CCD 是“引起交叉反应的糖类抗原决定簇”的简写。CCD普遍存在于大量植物或动物类过敏原中。由于它们结构的相似性，CCD 可引起很强的交叉反因。但大多数情况下，认为它们与诊断无关，但同时又对体外诊断阳性结果的解释造成影响。因此，引入抗CCD 类的特异性IgE 抗体的检测可能会提供有用的信息，尤其当IgE 阳性结果与临床表现不符时，会为我们解释检测结果提供帮助。
14. 4该试验可对特异性过敏原IgE进行测定，以确定究竟是对哪一种物质过敏。
15．实验性能参数：
15．1 检测范围：未稀释样本的测定范围是>0.35kU/l。
15．2 精密度：通过比较同一样本在相同时间内多次检测结果的差异来研究批内差异；批间 差异为用不同批号产品在不同时间对同一样本进行检测所得的差异。每一次实验，抗原带着色的深浅都在额定范围内。该欧蒙印迹法试剂具有很好的批内和批间重复性。
15．3灵敏度：采用Pharmacia CAP 系统为参考方法，本检测系统的灵敏度对于牧草(g6)为90%、白桦(t3)为90%、屋尘螨(d1)为83%、粉尘螨（d2）为84%、猫(e1)为97.9%、马(e3)为82%。。
15．4 方法学比较：与Pharmacia CAP 系统相比较，该试剂具有很好的特异性和灵敏度。
15. 5特异性：采用Pharmacia CAP 系统为参考方法，本检测系统的特异性为牧草(g6)为100%、白桦t3)为92%、屋尘螨(d1)为100%、粉尘螨(d2)为86%、猫(e1)为95.7%、马(e3)为100%。
16. 方法的局限性：
17．1 干扰因素：血红蛋白浓度小于5 mg/ml 的溶血、甘油三脂浓度小于20 mg/ml 的脂血和胆红素浓度小于0.4mg/ml 的黄疸对检测结果没有影响。
17. 2 利用该检测结果进行诊断时，最好结合病人的病史、临床体征和其他检查结果。
18．参考文献:
18．1 参照最新版试剂说明书
18．2 《全国临床检验操作规程》（第三版）
18．3 《实验诊断学》（王鸿利主编）

编写者：杨蔺
审核者：吕红根
批准者：范列英
日期：2009-3-5
日期：2009-3-18
日期：2009-4-30

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