过氧化氢酶3-氨基-1,2,4-三唑(ATM)的抑制剂在酿酒酵母中过氧化氢酶的生理作用.doc

Inhibition of Catalase by Aminotriazole in vivo Results in Reduction of Glucose-6-phosphate Dehydrogenase Activity in Saccharomyces cerevisiae Cells
M. Bayliak, D. Gospodaryov, H. Semchyshyn, and V. Lushchak
Department of Biochemistry, Vassyl Stefanyk Precarpathian National University, 57 Shevchenko Str.,Ivano
Frankivsk 76025, Ukraine; fax: +38
0342
714683; E
mail: [e-mail]
Received August 3, 2007
Revision received November 19, 2007
Abstract—The inhibitor of catalase 3-amino-1,2,4-triazole (AMT) was used to study the physiological role of catalase in the yeast Saccharomyces cerevisiae under starvation. It was shown that AMT at the concentration of 10 mM did not affect the growth of the yeast. In vivo and in vitro the degree of catalase inhibition by AMT was concentration
and time
dependent. Peroxisomal catalase in bakers’ yeast was more sensitive to AMT than the cytosolic one. In vivo inhibition of catalase by
AMT in S. cerevisiae caused a simultaneous decrease in glucose-6-phosphate dehydrogenase activity and an increase in glutathione reductase activity. At the same time, the level of protein carbonyls, a marker of oxidative modification, was not affected. Possible mechanisms compensating the negative effects caused by AMT inhibition of catalase are discussed.
摘要 过氧化氢酶3-氨基-1,2,4-三唑（ATM）的抑制剂常用来研究饥饿情况下酿酒酵母中过氧化氢酶的生理作用。结果表明ATM浓度在10 mM时，不会影响酵母的生长。在体内外过氧化氢酶的抑制程度由ATM的浓度和试剂有关。面包酵母中的过氧化氢酶对ATM比细胞质基质中的敏感。酿酒酵母中ATM对体内过氧化氢酶的抑制作用会同时降低葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，同时增加谷胱甘肽还原酶的活性。同时，蛋白质金属羰基合物的水平（氧化修饰的一个标志）不受影响。补偿负效应的机制可能是由AMT抑制过氧化氢酶引起的。
材料和方法
化学药品和酵母菌株 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苯甲基磺酰氟（PMSF）、异柠檬酸、EDTA和ATM都是从Sigma (USA) 获得的；NADP(H)、NAD(H)、2,4-二硝基苯肼、槲黄素、氧化型谷胱甘肽和TEMED是从Reanal (Hungary) 购买的，胍-HCl是从Fluka (Germany) 买的。无机化学材料是从Reakhim (Russia) 获得的。其他所有的化学药品都是高纯度的。酵母提取物是从BioGene (Great Britain) 获得的。
本实验中使用的酿酒酵母菌株如下：YPH250 (MATa trp1-Δ1 his3-Δ200 lys2-801 leu2-Δ1 ade2-101 ura3-52)、YTT7 (YPH250
Δctt1::URA3)、YIT2 (YPH250 Δcta1::TRP1) 和 YWT1 (YPH250
Δcta1::TRP1 Δctt1::URA3)。这些菌株都是由Professor Yoshiharu Inoue (Kyoto University, Japan) 提供的。
生长条件和细胞培养 细胞生长的培养基中含有1%的酵母提取物， 2% 的蛋白胨和1%的葡萄糖 (YPD)，在28℃、180 rpm下震荡培养24 h(A600 ~1.6
1.7)。离心(5 min, 7000g)获得酵母细胞并悬浮在0.9%的NaCl中。然后加入适当量的AMT，细胞在28℃、180 rpm下再震荡培养24 h。在体外抑制实验中，直接加入适当量的ATM到从固定生长的细胞中得到的上清中。
无细胞提取物的制备 按上述提到的方法获得实验培养物的细胞并用50 mM的磷酸钾缓冲液（pH 7.0）冲洗两次。酵母颗粒悬浮到溶菌缓冲液中，溶菌缓冲液中含有相同的缓冲液，1mM PMSF和0.5 mM EDTA。在冰上冷冻一分钟后，用同等体积的玻璃珠子(450-500 um) (Sigma)涡流来破坏酵母细胞。通过在4℃、15,000g下离心15分钟，去除细胞碎片。将细胞提取物放置在冰上，并在接下来的6h内使用。
蛋白质金属羰基化合物 通过测定使用 2,4-二硝基苯肼反应形成的2,4-二硝基苯腙的量来检测蛋白中羰基化合物的含量。使用消光系数为22 mM–1·cm–1，在370 nm下测得的2,4-二硝基苯腙的最大吸光值来计算羰基化合物的含量。
酶活的测定 一个SOD活力单位定义为抑制槲皮素氧化最大速率一半时上清中可溶性蛋白的量。通过监测培养基中NADP的减少来测定G6PDH活性，培养基中含有50 mM磷酸钾 (pH 7.0)，0.5mM EDTA，5.0 mM MgSO4，0.2 mM NADP，2.0 mM 葡萄糖-6-磷酸和30 ul的上清（1ml终体系）。通过监测培养基中NADPH消耗的量来测定谷胱甘肽还原酶（GR）活性，培养基中含有50 mM磷酸钾(pH 7.0)，0.5mM EDTA，1 mM 的氧化型谷胱甘肽，0.25 mM NADPH，和50 ul的上清（1ml终体系）。通过监测培养基中NAD的还原来测定异柠檬酸脱氢酶（ICDH）的活性，培养基中含有50 mM磷酸钾(pH 7.0)，0.5mM EDTA，0.25 mM NAD，0.5 mM 异柠檬酸和100 uL的细胞提取物（1ml终体系）。通过监测培养基中NADH的氧化来测定乳酸脱氢酶（LDH）的活性，培养基中含有50 mM磷酸钾(pH 7.0)，0.5mM EDTA，0.16 mM NADH，1 mM 丙酮酸和60 uL的细胞提取物（1ml终体系）。在2 ml培养基中测定过氧化氢酶的活性，培养基中含有50 mM磷酸钾 (pH 7.0)，0.5 mM EDTA，10 mM过氧化氢和100 ul的细胞提取物（2 ml终体系）。在240 nm 处测过氧化氢的消耗量（过氧化氢的消光系数为39.4 M–1·cm–1）。
G6PDH、GR、ICDH、LDH和过氧化氢酶的一个活力单位被定义为每分钟利用或产生1 umol 的底物或产物的上清中蛋白的量。所有的活性都是在25 ℃测的。
蛋白浓度和统计分析 以牛血清白蛋白为标准，用Coomassie Brilliant Blue G-250 dye-binding 的方法来测定蛋白浓度。实验数据表示为4-6个独立实验的平均值±平均数标准误差（SEM），统计检测用Student’s t-检验。
结果和讨论

在保护细胞组件上，过氧化氢酶的参与在很大程度上依赖于酿酒酵母的培养条件、生长阶段等。为了减少AMT对其他代谢过程的干扰，我们采用饥饿模式，在这个模式中，新陈代谢相对迟缓并且主要集中在生存上。
为了测定AMT的亚致死量，在含有不同浓度抑制剂培养基中培养酵母细胞。实验表明，事实上1-10 mM ATM并不影响酿酒酵母YPH250 野生型菌株的生长（表2然而，在以前的研究中，我们发现AMT处理在浓度高于20 mM时，会使饥饿酵母细胞的存活率降低20%。因此，在以后对饥饿酵母的实验中，我们使用的AMT浓度在10 mM以上，10 mM以上的AMT几乎没有毒性。

表3中展示了在体内，不同AMT浓度对YPH250野生型菌株中过氧化氢酶活性的影响。像预期的那样，过氧化氢酶的活性随着抑制剂浓度的增加而降低。1 mM的AMT会使过氧化氢酶的活性降低约1.5倍，在10 mM 的AMT作用下过氧化氢酶的活性降低约3倍。后面我们将研究不同浓度的AMT对体外亲本菌株和单一突变菌株中过氧化氢酶的影响。正如表4a，细胞用10 mM的AMT处理10 h会使野生型菌株的过氧化氢酶活性降低四倍。应该注意的是不管是在YPH250 (野生型) 或是在YTT7 (ΔCTT1)，过氧化氢酶的活性同样都依赖于AMT的作用时间(Fig. 4, a和c)，而且比YIT2 (ΔCTA1) (Fig. 4b)对抑制剂更敏感。同时，20-50 mM 下的AMT处理对亲本中的酶的抑制程度与对YIT2 (ΔCTA1)菌株(Fig. 4b)中的相似。从YTT7细胞（只表达过氧化氢酶A）中获得的提取物中，用50 mM的AMT处理时过氧化氢酶的抑制程度最高。在这种情况下，用50 mM的AMT处理5 h，提取物会完全丧失过氧化氢酶活性，而同样的处理过程，从YIT2菌株（只具有过氧化氢酶T）获得的提取物失去约80%的活性。

表1中给出了在三种菌株的空载细胞提取物中，由50 mM的AMT抑制的过氧化氢酶的动力学参数。随着曝光时间的增加，抑制常数I50会下降。然而，从YTT7 (ΔCTT1)细胞中获得的提取物中，I50的值在培养的第一阶段下降的更为明显。对所有使用的菌株来说，在培养的2.5-5 h之间，I50的值会急剧下降(2-3倍)。对胞质过氧化氢酶(YIT2菌株)来说，每曝光2.5 h, I50的值会降低约2倍。这种菌株的过氧化氢酶最耐AMT。需要注意的是，亲本抑制常数的改变并不是相应的单突变体常数简单的加和。
我们获得的在整个酵母细胞和细胞提取物中抑制过氧化氢酶的数据与先前对微生物和动物的数据一致。在酿酒酵母细胞中，过氧化氢酶的抑制会产生大量的过氧化氢，转而会增加自由基对不同的细胞组分的破坏。

大家都知道用作除草剂的氨基三唑能抑制参与组氨酸生物合成的咪唑甘油-磷酸脱氢酶（IGPD）。因此，AMT最明显的影响是使组氨酸饥饿。尽管有人认为AMT像组氨酸模拟的那样影响组氨酸的合成，然而在文字中还没有确切的证据。考虑到上面提到的建议和其他的数据，至少有两种或更多的可能性可以来解释我们上面讨论的现象：(i) 抑制剂可以与IGPD的活性位点相作用；(ii) 高活性的代谢物如•OH会使IGPD失活，这是因为过氧化氢水平的增加是由过氧化氢酶抑制造成的。
两种假设都要用纯化的酶在体外检验。然而，在原生细胞中，第一个建议是不可能的，第二个建议的检测似乎也很复杂。
我们的工作是为了最大限度地排除与AMT存在相联系的其他流程和进一步阐明过氧化氢酶在体内细胞组件的保护作用。这就是酵母细胞在没有任何营养物的情况下接种到0.9%的NaCl溶液中的原因。众所周知，相似的条件能大幅增加酵复制的生命周期。
接下来，我们研究了体内AMT对不同酶活性的影响。表2说明AMT处理并不能明显的改变SOD, ICDH, LDH和蛋白质金属羰基合物。同时，用10 mM AMT处理，GR活性比对照组增加1.4倍。另一方面，随着抑制剂浓度的增加，G6PDH 的活性逐渐降低。在AMT曝光下，对G6PDH和过氧化氢酶活性作图时，发现他们成正相关（Fig.5）。
Table 2. Activities of superoxide dismutase (units per mg of protein), glutathione reductase, glucose
6
phosphate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, and isocitrate dehydrogenase (nmol NAD(P)H/min per mg of protein) and carbonyl protein levels (nmol per mg of protein) in
S. cerevisiae YPH250 cells treated with different AMT concentrations in vivo for 24 h

在以前的酿酒酵母在乙醇上生长的工作中，我们发现CP水平越高，过氧化氢酶活性越低。过氧化氢酶活性与CP水平成负相关。在金鱼的大脑和肾脏中，即由AMT抑制的过氧化氢酶与之相似——过氧化氢酶活性与CP水平的负相关性很高。相反，在这项研究中，我们没有发现在由AMT抑制的过氧化氢酶作用下，CP水平的改变。
一般，低的过氧化氢酶活性伴随着对氧敏感的酶的活性的降低。许多不同的酶，包括抗氧化剂和与之相关的酶，在不同条件下，在不同的生物体中，氧化性会失活。在这项研究中，我们发现SOD, G6PDH, GR, LDH和ICDH易被氧化。同时，检测上面提到的各种酶活性可能的改变是很有趣的，因为上面的后面四种酶负责保持还原性辅酶的水平。可以预测到这些酶活性的降低伴随着过氧化氢酶的失活，但这也不是必须的。
开始的时候我们发现过氧化氢酶活性的缺失与较低的GR活性有关。相反，在这个研究中，用10 mM 的AMT处理，GR活性会增加。在金鱼的大脑和肾脏中，注射AMT会增加谷胱甘肽-S-转移酶及谷胱甘肽过氧化物酶的活性。
最后，表2表明过氧化氢酶的抑制与G6PDH活性的降低成很高的正相关性Fig.5）。为了检测AMT是否可以直接影响G6PDH的活性，我们检测了抑制剂在体外无细胞提取物中对酶活的影响。与过氧化氢酶相反（Fig.4），没有任何AMT的浓度可以改变破碎细胞上清中G6PDH的活性。此外，我们还检测了AMT对双基因编码的失活的菌株中G6PDH的影响。与野生型细胞相反，在这种情况下，我们发现在AMT的存在下，酶的活性没有降低。
可以断定的是，AMT是一个有用的工具来研究过氧化氢酶在酿酒酵母细胞中的生理作用。用AMT处理酵母可能会产生轻微的氧压，但是不影响氧化型蛋白的水平，也不会改变对ROS敏感的酶的活性。同时，在这项研究中用到的条件下，G6PDH可能作为评价活细胞中低强度氧化的自由基的一个指标。