第十二章DNA合成—复制.doc

《动物生物化学》授课内容
内 容
备 注
第十二章 DNA合成—复制

概念：遗传中心法则
1、遗传信息贮存在DNA上，通过以单链为模板合成两个完全相同的子代方式，将信息传递给子代，称为复制。
2、以DNA为模板指导合成RNA（转录）后，再以RNA为模板指导合成蛋白质（翻译），将DNA上的遗传信息以蛋白质的形式和相应的功能表达出来。称为遗传中心法则。
3、RNA病毒是以RNA为遗传信息的载体。这种特殊的RNA也可以进行自我复制，并在相应逆转录酶存在下，将信息逆转录合成DNA，然后沿中心法则的方式进行信息传递。

半保留复制（semiconservative replication）
复制前，双螺旋的氢键断裂形成单链，再以单链为模板，合成各自互补链，产生2个与亲链完全一样的子代DNA。
每个子代双链中均含有一条亲代模板链和一条新合成链（旧、新单链互补结合而成）。

13.1 复制因子
DNA复制系统由多种蛋白酶、RNA引物和Mg2+等组成。
（1）DNA聚合酶 以脱氧核苷酸为底物，以DNA为信息模板，在Mg2+存和引物存在条件下，催化合成DNA链。
DNA合成方向从5′→3′，即dXNA的5′位磷酸加到引物的3′端OH，脱焦磷酸形成二酯键。

原核细胞以大肠杆菌（E.coli）DNA聚合酶为代表.
聚合酶Ⅰ 单链，101000;5′→3′聚合；3′→5′外切（校对功能。3′端接
上错误核苷酸后将被切除）；5′→3′水解（可以切除引物和修复性切除）。
聚合酶Ⅱ 多亚基蛋白酶，88000；具5′→3′聚合，3′→5′外切 作用；
但合成速度很慢，主要为切除修复的功能。
聚合酶Ⅲ 有10个亚基，900000；具5′→3′聚合，3′→5′外切作用；
合成速度最快，是DNA复制的主要合成酶。

真核细胞也有功能类似的聚合酶（有五种）：
聚合酶α、δ是主要合成酶（具5′→3′聚合和校正功能）；
聚合酶β、ε为主要的修复酶；
聚合酶γ主要存在于线粒体，含量极少，负责线粒体DNA的修复。

（2）DNA连接酶 催化双链中单链切口处5′—P与3′—OH间的共价连接；消耗ATP(真核)或NADH (原核)供能。
对单链分子不起作用。

（3）DNA构象转换因子 参与DNA分子的解链、解旋、稳定单链作用。
DNA解旋酶： 多数DNA都有负超螺旋，由拓扑异构酶产生或解除。
（E.coli的解链酶称为danB蛋白，或称rep蛋白）
拓扑异构酶Ⅰ 可切双链中的一条单链，放出应力后再连接，无能量消耗；
拓扑异构酶Ⅱ 具双链内切酶与连接酶双重功效；消耗ATP；先切开双链，
释放应力（或引入负超螺旋），再封闭切口。但没有解链功
能（不能打开氢键）。
注：拓扑异构酶在原核、真核生物都存在
DNA解链酶： 具识别复制原点的特殊位点；促链间氢键断裂、分离为单链，解螺旋；消耗ATP（具有依赖DNA的ATPase活性）；降低DNA的Tm；（与SSB联合，打开DNA双链，并维持单链稳定）。
E.coli的解链酶称为danA蛋白

链结合蛋白（SSB）： 紧密结合到单链DNA上，使DNA单链不能互补结合，并保护单链不被核酸酶降解，维持单链稳定性。

（4）引物及合成酶 引物链为一段特殊RNA，聚合酶在此链基础上合成延长DNA。专一合成此RNA的称为引物酶。
DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能延长DNA；
原核生物的引物为40—50核苷酸，动物病毒有80个，真核生物有5—10个。

引物（发）酶（E.coli中为danG蛋白），单链，以多酶复合物形式存在在。引物酶只在形成复合体时才有活性。
引物RNA能与模板DNA以氢键配对结合，形成局部杂交链。
合成引物时，多酶复合体与拓扑异构酶等配合，对DNA局部进行解旋，暴露出后续的DNA序列，有利于DNA聚合酶复制，称为“转录激活”。

（5）原料等其他条件
1、四种脱氧核糖核酸（dXTP）；
2、反应体系中适宜的PH和离子强度；
3、[Mg++]条件等。
13．2 DNA复制过程
（1）复制点 无论真核、原核均有固定起点位；原核生物一般只有一个点，而真核生物则多点同时复制。
真核DNA比原核长很多，多点同时复制能提高速度。
复制均为双向，可产生两个复制叉。当复制点为单向复制时，则只有一个复制叉。
（2） 起始
复制前先由 Dna A：辨认复制起始位点；
再由 解旋酶（含拓扑异构酶）作用，释放超螺旋应力后，
然后引入多酶复合体（包括解链蛋白、单链结合蛋白SSB、引物酶danG、ATP辅助因子等）。
解链酶打开局部双链，使SSB蛋白与单链DNA结合，维持稳定；
以后引物酶开始以单链DNA为模板，利用4种核糖核苷酸（XTP），合成引物RNA。
注：在复制叉上引入2个多酶复合体，作用方向相反。
Dna A：辨认复制起始位点，并参与解链功能。
　　 Dna B：解螺旋酶
　　 Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上结合并打开双链。
Dna G：引物酶

（3）复制延伸 引物合成后，DNA聚合酶Ⅲ全酶（多亚基）随后引入结合在DNA模板上，将游离的dXTP的5′端磷酸基与RNA的3′端OH相连，形成酯键，放出ppi。
同时，拓扑异构酶、解链酶、BBS蛋白、聚合酶等开始同时作用，边 解螺旋、解链，边合成，新链不断向 3′方向延长（聚合方向为 5′→3′）。
3′→5′ 模板链：聚合酶沿模板3′→5′前进，合成一条5′→3′的新
链，速度较快，称为先导链；
5′→3′ 模板链：聚合酶采用片段合成，片段称为“冈崎片段”。
DNA聚合酶为多亚基酶，与引物酶复合体靠近，可将游离的模板单链（5′→3′）
局部折成环，使部分片段与先导链同向，便于引物酶合成引物、聚合酶延长DNA链（5′→3′）。
当达到一定长度后环被放开。再产生一个新环，重复前面的过程。
合成的片段，再由聚合酶Ⅰ切除引物RNA，并继续从5′→3′方向修复合成；最后由连接酶将缺口补上，完成复制。
这一过程所合成的链，因步骤多、速度慢而称为滞后链。

在整个合成中，DNA聚合酶始终承担合成、校对、修复功能。以模板为标准，严格选择底物dXTP；出现错选、错接时立即切除修复，极为精确。
（4）复制终止
对环形DNA链，终止点即在起点处；对长链，终止处可以是某一组密码控制，或与前一复制叉相汇处。
13．3 反转录合成DNA
针对RNA型病毒。含有特殊的RNA反转录酶。
① RNA反转录酶：以dXTP为底物，以特殊的RNA为模板、合成方向5′→3′，合成的双链产物（称反链）为RNA—DNA混合链；
② 再由核糖核酸酶降解链中RNA成片段，作为引物；
③ 在DNA聚合酶Ⅰ参与下以反链DNA为模板，以RNA为引物，合成方向5′→3′，合成含有原RNA信息的新DNA双链。

上述过程只有借助宿主细胞内的酶系统和环境条件才能完成；形成的病毒DNA可整合到宿主DNA中。一定条件下，这样的宿主DNA可以大量复制并转录出病毒RNA，重新组装新的病毒，散布到胞外或诱发宿主细胞癌变等。

13．4 DNA损伤修复
DNA损伤大多是由于环境因素引起，另一原因是遗传错误。但生物可以依靠细胞内存在的一系列校对、修复机制得以解决。
光修复 紫外线常导致核酸链上相邻T形成共价二聚体T=T，而引起复制 终止。在某些物种则具有能被光 激活的特定的光修复酶，分解T=T成单体，修复紫外线破 坏的核酸链。
（人体的此酶活性偏弱，过量紫外易引起细胞死亡或诱发癌。）
暗修复主要有三种：
1、 切除修复
① 特异核酸内切酶识别并切断双链中单链上的问题核苷酸二酯键；
② 由外切酶将问题核苷酸片段切除；
③ 由DNA聚合酶对空缺处进行修补，并留下切口；
④ 由连接酶连接完成修复。
着色性干皮病（xeroderma pigmentosis，XP）
一种切除修复有缺陷的遗传性疾病。包括XPA、XPB、XPC等相关基因的表达产物，具有辨认和切除损伤DNA作用。XP病人则是由于XP基因缺陷而不能合成相应产物，则不能修复紫外线照射引起的DNA损伤，因此易发生皮肤癌。

2、重组修复： 亦称复制后修复。即受损DNA片段在复制时通过交换重组得到修复。但受损的部分并没有被消除，而是通过不断复制的大量DNA而被“稀释消除”。
多酶链式反应（PCR
一种快速人工合成特定DNA片段的技术。
条件： 微量DNA片段、dNTP为底物（四种）、耐热性DNA聚合酶
（TaqDNA 聚合酶，可耐95℃）、人工合成的引物、合适的离子强度和PH、缓冲液、 Mg2+等。
PCR过程：
一 高温变性（高温可以使DNA成为单链，聚合酶耐高温
不失活）；
二 低温退火（降温使引物与DNA单链结合，DNA单链极低
浓度则不能结合复性）；
三 中温延伸（75—80℃促进聚合酶以引物为起始 点，以
DNA单链为模板，开始合成DNA互补链）。

注：端粒与端粒酶
端粒酶是一种核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白质组成，具有逆转录酶的功能，以自身的RNA为模板不断合成端粒DNA，从而维持端粒的长度。
端粒是真核生物染色体末端的特殊结构，由部分双链和一段3′单链组成，上有特殊的保护蛋白，使外切、内切酶均不能识别和破坏。
人类端粒是由10～15Kb的重复序列(TTAGGG)组成。正常人体细胞，端粒随细胞分裂的次数增加而不断缩短，当达到一定程度，细胞就衰老死亡，称为细胞生命的分子钟。端粒酶的激活可使端粒长度保持相对稳定，从而使细胞获得永生，某些癌变细胞就具有这一性质。

本章主要内容：

中心法则
DNA复制的半保留性
DNA的复制过程与反转录
   DNA的损伤修复和 PCR

课程编号：
10100500

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