重组DNA技术精简版.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,基因重组与基因工程,Gene recombination,and genetic engineering,孙庆涛 刘华明,2011.3.16,重组,DNA,技术又称为基因工程（,genetic engineering,）或分子克隆,（,molecular,cloning,）,。,基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：,载体和目的基因的分离,载体和目的基因的切断,载体和目的基因的重组,重组,DNA,的转化和扩增,重组,DNA,的筛选和鉴定,一、载体和目的基因的分离,为了进行基因重组，首先需要对载体,DNA,和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。,（一）载体：,基因工程中常用的载体,(vector),主要包括,质粒,(plasmid),噬菌体,(phage),病毒,(virus),这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。,1,质粒：,存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的,双链环状,DNA,，具有,独立复制,的能力，通常带有细菌的,抗药基因,。,最早使用的质粒,DNA,是人工构建的,pBR322,，该质粒分子大小为,4.3kb,，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含,EcoR,，,BamH,，,Hind,等单一的限制酶切点。2,噬菌体：,可通过转染方式将其,DNA,送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的,噬菌体载体,。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体,DNA,进行重组时，可采用,插入重组方式,，也可采用,置换重组方式,。,3,病毒：,常用的为,SV40,，通过感染方式将其,DNA,送入哺乳动物细胞中进行增殖。,（二）目的基因：,目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行：,1,直接从染色体,DNA,中分离：,仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。,2,人工合成：,根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。,3.,从,mRNA,合成,cDNA,：,采用一定的方法钓取特定基因的,mRNA,，再通过逆转录酶催化合成其互补,DNA,（,cDNA,），,除去,RNA,链后，再用,DNA,聚合酶合成其互补,DNA,链，从而得到双链,DNA,。这一方法通常可得到可表达的完整基因。,4,从基因文库中筛选：,将某一种基因,DNA,用适当的限制酶切断后，与载体,DNA,重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组,DNA,的种群，称为,G-,文库,(genomic DNA library),。,将某种细胞的全部,mRNA,通过逆转合成,cDNA,，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为,C-,文库,(cDNA library),。,C-,文库具有组织细胞特异性。,5,利用,PCR,合成：,如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（,polymerase chain reaction,PCR,）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。,PCR,概述,PCR,：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用,DNA,合成 酶和四种脱氧核糖核酸进行,DNA,的体外合成反应。,PCR,技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。,该技术在上个世纪,80,年代中期由美国,K.Mullis,发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，,K.Mullis,也因此获得,1993,年度的诺贝尔化学奖。,PCR,基本原理,DNA,在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是,DNA,聚合酶、,DNA,连接酶、引发酶、,DNA,引物、四种脱氧核糖核酸、,DNA,超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。,PCR,是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的,DNA,复制，所以在一个,PCR,中必需成分是,1.,模板,DNA,2.DNA,聚合酶,3.,四种脱氧核糖核酸,4.,正向和反向两条引物,5.,适当的缓冲体系。,变性：是指模板的热变性，双螺旋模版,DNA,成为单链的,DNA,分子；在应用,Taq,DNA,聚合酶进行,PCR,反应时，变性往往在,94,95,条件下进行。这也是,Taq,DNA,聚合酶进行,30,个左右的,PCR,循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。,退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低,5,10,，,PCR,实验要对退火温度进行优化。,PCR,基本步骤,延伸：在镁离子存在条件下，,DNA,聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引物的,3,端，使引物沿,53,方向生成与模版,DNA,互补的新,DNA,链。,双链模版,DNA,变性,退火,5,35,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,上游引物,下游引物,延伸,3,5,5,3,3,5,5,3,多次循环,（,2,n,拷贝）,1,、目的基因的克隆,2,、基因的体外突变,3,、,DNA,和,RNA,的微量分析,4,、,DNA,序列测定,5,、基因突变分析,PCR,的主要用途,二、载体和目的基因的切断,通常采用,限制性核酸内切酶,(restriction,endonuclease),，简称限制酶，分别对载体,DNA,和目的基因进行切断，以便于重组。,限制酶目前已经发现,400,多种，所识别的顺序往往为,4-8,个碱基对，且有,回文结构,。,由限制酶切断后的末端可形成,平端、,3-,突出粘性末端和,5-,突出粘性末端,三种情况。形成粘性末端,(cohesive end),者较有利于载体,DNA,和目的基因的重组。,三、载体和目的基因的重组,即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的,DNA,分子。,（一）粘性末端连接法：,当载体,DNA,和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入,DNA,连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。,较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。,（二）人工接尾法：,即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。,此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的,3-,端，如载体上添加一段,polyG,，则可在目的基因上添加一段,polyC,，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由,DNA,连接酶连接。,（三）人工接头连接法：,将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的,DNA,片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。,四、重组,DNA,导入受体细胞,（一）转化（,transformation,）,转化是指将质粒或其他外源,DNA,导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮在,CaCl,2,溶液中，并置于低温（,0,5,）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源,DNA,的能力，这种细胞称为感受态细胞（,competent cell,）。,(,二,),感染（,infection,）,噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组,DNA,分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内繁殖。由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（,transduction,）。,(,三,),转染,（,transfection,）,转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源,DNA,片段而获得新的表型的过程。,常用的方法有电穿孔法（,electroporation,）、磷酸钙沉淀法、脂质体融合法等。进入细胞的,DNA,可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。,五、重组,DNA,的筛选和鉴定,由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行：,（一）根据重组体的表型进行筛选：,对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用,插入灭活法,进行筛选。如,pBR322,中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。,插入灭活法筛选重组体,（二）根据标志互补进行筛选：,当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体,DNA,分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。,（三）根据,DNA,限制酶谱进行分析：,经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其,DNA,，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。,（四）用核酸杂交法进行分析鉴定：,为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的,DNA,片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。,获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。,谢谢！,