Journal of Cereal Science 55.doc

高分子量和低分子量麦谷蛋白对小麦籽粒的
应力松弛和沉降与流变特性的影响
文章历史：初稿：2011-3-1；修改：2012-1-12；接收：2012-1-17
摘要：36种面包麦粒系列的应力松现象为是通过使用指数项为4的广义麦克斯韦模型进行研究的。数据包括四个松弛阶段，两个快速阶段在1~10s(τ1 和τ2)的较短时间内，两个缓慢阶段在约50~450s (τ3 和τ4)的较长时间内。应力主要与籽粒的机械性能相关。跟小麦Glu-A1位点1和2*相比，小麦Glu-A1位点null的弹性和应力单元有所不同。Glu-B1和Glu-D1位点显示出应力的差异。GLU-A3位点只影响籽粒机械性能，而Glu-B3位点则显示出质量参数和机械性能两方面的差异。对具有SDS-沉降量和较长的混合时间的基因型来说松弛时间τ3较高。τ3为45~60s的基因型通常具有良好的高分子谷蛋白亚基背景和低分子量等位基因组合，它们一般都拥有优良的品质。正如预期的那样，具有短期松弛，混合时间和沉降体积不佳的基因型都是GLU-A1位点null，Glu-B3位点Ĵ1B/1R和GLU-A3 E（null）的样本。HMW-GS和LMW-GS等位基因，尤其是Glu-3等位点的差异在应力松弛中有所体现。这种差异跟SDS沉淀，混合和面筋拉力测定仪的数据相关联。
关键词：小麦；高分子量谷蛋白亚基；低分子量谷蛋白亚基；应力松弛；麦克斯韦模型；松弛时间。
1. 前言
面筋蛋白的高分子量聚集体和低分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS和LMW-GS）和麦醇溶蛋白（醇溶谷蛋白）.一些研究表明：当麦谷蛋白被水合时，它表现出非比寻常的黏弹特性，而且它也是影响小麦面粉面团的流变特性和面包质量的根源。最近有关一定量的水中小麦籽粒的粘弹性的研究可以在文献中找到。然而，尽管过去有相当多的关于小麦HMW和LMW- GS流变性质的研究,但那时对小麦籽粒的麦谷蛋白亚基的机械和粘弹性方面的基本信息和数据是非常有限的。
小麦籽粒，像所有其他谷物一样，也是在收获，处理，传输，加工，存储，调节和研磨过程中经受一系列静态和动态负荷。这些负荷会对麦粒造成重大的损害，这种损害会导致麦粒本身与HMW和LMW- GS特定成分有关的内在质量的减少，也会使麦粒在贮存期间更容易变质。由于麦粒的流变性和机械性特点是由HMW和LMW- GS成份以及麦粒的受压、负荷情况决定的， 而这两大特点则决定了麦粒的损伤类型和范围。因此，研究谷物的力学和粘弹性性能，如弹性模量、抗压强度和应力松弛是非常重要的。
谷物的力学现象被发现是与时间有关的。粘弹性材料具有应力松弛现象，这是农业原材料的一些最重要特征。测量松弛时间显示材料如何快速使突然变形后的应力消失。压缩负荷通常对农业产品产生机械损伤，因而压缩试验得出的数据比拉伸实验的更多。
在应力松弛试验中，应用恒应变和应力维护形变作为衡量应力时间的函数。在应力松弛实验当中，可以观察到不同的现象：理想的弹性材料不松弛，而理想的粘性材料马上显示出松弛。粘弹性固体的逐渐松弛，达到平衡压力大于0 ，而对于粘弹性流体，残余应力将为零。
Maxwell模型是由一个是适合于理解应力松弛数据，但不考虑弹簧和一个黏壶串联组成，可以用来反映应力松弛过程，但是不考虑平衡应力。因此，食品的粘弹现象为可以通过广义的Maxwell模型来描述，即由几个元素组成的平行弹簧来描述。在同一个模型中，如果系统受到恒定的应力，则总应变为各元素应变的总和。
Figueroa等人的研究已经表明，麦粒的粘弹现象为可以由广义的Maxwell模型来表示。这个方法已经成功验证了在检测面团，玉米粉，面糊的变化所需的时间与温度的函数。Bargale和Irudayaraj（1995）表明，三个条件的Maxwell模型可以很好的描述小麦籽粒的应力松弛行为。一些学者研究了三种应力松弛情况，即将Maxwell模型推广去匹配这些实验数据。他们表示，经过推广的Maxwell模型在预测实验数据这方面是最好的模型。
因此，本研究有以下几个具体的目标：1、确定HMW-GS和LMW-GS对弹性模量、应力松弛以及与质量有关的SDS沉淀值和混合数据的影响；2、描述出小麦籽粒的应力松弛时的应力。
2. 实验方法
2.1. 植物材料
索诺拉、墨西哥国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）种植的 36种小麦系列，在2006 ~2007的作物周期进行了研究。十二烷基硫酸钠-硫酸-聚丙烯酰胺-凝胶电泳(SDS-PAGE)协议做了一些修改被用来确定高分子麦谷蛋白亚基和低分子买谷蛋白亚基的组成。
2.2. 不同小麦的物理性质和化学性质
水分含量可以通过44 -15A(AACC Itl 2000)，这种已经批准的方法来检测。籽粒厚度代表着谷物背侧部分的最高点，它可以通过使用三丰CD-6”CS数字游标卡尺（日本三丰公司）来测量，至少一式两份进行分析。
2.3. 四种质量试验
谷物在老布拉本德磨粉机上磨成面粉样本，精制面粉被用来评估SDS-沉降(1990)，在粉质曲线中面团搅拌时间和面团强度(W)、黏性,坚韧/可扩展性(P / L比值)在面筋拉力测定仪都是根据AACC的方法(分别是54-40A和54-30A,AACC Itl 2000)来测定的。
2.4. 单轴压缩试验
质构仪用来测定籽粒响应压缩载荷，使用的是不锈钢探针一个纹理分析器TA-XT2(纹理技术公司,稳定的微系统,萨里郡,英格兰)是用来测量内核响应压缩载荷使用不锈钢探针TA-5105(直径10毫米)。在测量之前，将籽粒样本被放置在一个恒温室(20℃)24h以减少方差分析的测量。在加载过程中 每个籽粒的接触(受力)区域由以下因素决定： 每个籽粒被轻轻压在一个印台,将折痕安置在仪表基座，将几张铜版纸(30×30毫米)放置在籽粒的顶部用来记录在加载过程中墨水印象的籽粒接触表面.墨水的形象印象被数字化且面积计算使用的是ImageJ软件. Ponce-García报导图像分析使用的是扫描籽粒接触面的照片，曾挑战包括所有微弱的灰色区域的边界支承面积。如果这个区域不解释清楚,它会高估弹性模量。在这项研究中,黑白扫描图像和黑色和白色的阈值提高了，提高了面积测量的准确性。
质构仪测试设置如下：载荷变形从小麦籽粒的表面开始，在探针插入0.5毫米(压缩)，间隙是4mm。数据的收集使用每秒25个点，加载速率为0.1 mm /s，也是质构仪在25000g负载细胞的最低速率。据报道平均从6独立籽粒每种基因型。
2.5. 应力松弛实验
为了描述小麦籽粒的粘弹行为，因而采用一个无质量的、机械式的广义Maxwell模型去试图把它描述成分子层面的活动。这个模型是由弹簧（理想固体,即粘弹性材料的弹性行为）和阻尼器（理想液体，即液体的粘性行为）许多不同的方式下的结合（如图1）。

图1： 广义的Maxwell模型由一个单一的弹簧常数与i个阻尼器（）的Maxwell元素模型相并联来表示，并且考虑粘性行为和弹簧的弹性行为（松弛量，）。
在应力松弛实验当中，应变为0.5毫米可以应用于25点每秒和加载速率0.1毫米/秒的特定斜坡上，然后在600秒的应力松弛阶段位移保持不变。同时，反应力和应力-时间历程都被记录下来。Figueroa等人发表的广义Maxwell模型（2011A）用于计算的小麦籽粒的粘弹行为。如图1，在本研究中，该模型由四个元素组成，并与弹簧并联。根据恒定的应变或变形的应用，通过模型表达出的粘弹性函数可由下面的指数方程来描述：
（1）
且 （2）
其中， 表示松弛时间t后的应力的衰减参数，表示第i个Maxwell元素的衰减应力，表示第i个Maxwell元素的松弛时间或者表示该应力衰减到1 / e或其原始值的约36.8%所需的时间周期（Mohsenin，1986），表示第i个元素的粘度，而表示麦粒的应变。表示平衡应力或无限的时间后的应力的渐近参数（它对应于并联的Maxwell元素组的单弹簧常数）或由于纯弹性元件的剩余弹簧应力（Figueroa等人，2011a）。
2.6. 弹性与塑性元件的压缩加载测试
小麦籽粒的粘弹性的计算是使用压缩实验，具体的压缩工作是装载/卸载曲线，加载曲线下的面积给出了总的工作(Wt)由装载装置在压缩。在卸载时,对这一部分工作可以恢复,代表可恢复工作或弹性的贡献(We)的总功。总功和弹性工作的不同在于这项工作由塑性变形单独耗散，Wp = Wt-We。
2.7. 统计分析
方差分析的结果都使用了SAS统计软件,版本9.2的一般线性模型程序（软件研究所，2009），多重比较的方法使用了邓肯多个范围测试在α=0.05水平。回归分析是利用GraphPad棱镜5.0(赫恩科学软件公司，墨尔本、澳大利亚)和OriginPro 8软件(OriginLab公司,美国北安普顿马)。
3. 结果与讨论
3.1. 广义麦克斯韦模型的选择
据已有资料关于小麦籽粒的报道表明， 3个麦克斯韦元素在特定条件下，0.5mm的位移和1 mm / s加载速率是获取小麦不同含水量和位移条件下重要的质量数据的条件。然而,应力松弛在测试180s后是不完整的，所以还没有达到平衡，这表明超过180s在应力松弛阶段是需要的。Matsumoto在早期的工作中，使用拉伸仪测定面团的结构弛豫也得出了类似的结论，表明面团的行为不能被表示为一个单一的麦克斯韦模型,但是大量的模型分布在一个松弛时间介于1~ 1000s的范围。在目前的研究中600s的应力松弛阶段是使用几个(3、4、5或者6)麦克斯韦元素在弛豫模型进行评估(数据未显示)。在5麦克斯韦元素的模型中一些籽粒重复显示剩余均方低于1.1×10-4和较高R2(约0.9999)以适应该特定元素的回归分析的指数方程。但是,麦克斯韦元素的相关性与sds沉降体积和面团流变特性(混合数据)是相对于3和4个麦克斯韦元素模型。6元素模型,另一方面,显示出一些负面的应力松弛时间和物理方面的不可能性。在目前的研究中,一个4元素麦克斯韦模型可将数据呈现。广义麦克斯韦模型为完整的小麦籽粒拟合回归指数为4的应力松弛曲线，其中在所有基因型的重复试验中R2在0.9992~0.9999，剩余均方在1.3 ×10-4到6.6×10-6。
3.2. HMW-GS和LMW-GS对小麦的质量和力学性能的影响
从表1的数据表明，Glu-3位点比GLU-1位点对沉淀和内核弹性的影响更大。Glu-A1位点在应力和塑性功表现出显着的差异，而GLU-B1只在应力表现出差异。在这项研究中，不能准确评价Glu-D1位点对大多数含有5 +10样品的影响。由于本研究的限制，Glu-D1位可能会影响混合和塑性功。另一方面，Glu-A3位点只影响内核的机械性能（E，应力，力，We和Wp），而Glu-B3位点在质量参数和机械性能表现出显着的差异。tsenov等人（2010）和Figueroa等人（2011c）发表了类似的结果，他们认为无论HMW-GS的背景怎样，Glu-A3位点和 Glu-B3位点影响小麦的最终使用质量。
3.3. HMW-GS和LMW-GS对材料的时效行为的影响：粘弹性
等式（1）和等式（2）中的松弛应力和松弛时间，可以从完整的小麦籽粒的压缩松弛曲线计算如表2所示。应力松弛常数表明，Glu-A1位点、Glu-B1位点显著影响着4个Maxwell元素和纯弹性元件的应力（）。目前的数据有两个样品中含有2+12亚基在Glu-D1位点可能会影响应力松弛性能。Glu-3位点在应力松弛性能表现出重要的作用，尤其是Glu-B3和Glu-A3位点。这些观点与先前3.2节提出的观点类似，即Glu-A3和Glu-B3位点在质量参数和机械性能显示出显着的差异。
表3根据有四个元素的广义的Maxwell模型的参数估计，得出了方差分析的平均值。Glu-A1 位点的空亚基的四个应力单元、、和与Glu-A1 位点的亚基1和2 *的相比，在弹簧的装置有显著的差异。在Maxwell元件的，和应力作用下，Glu-B1位点显示出差异，而亚基5+10和亚基2+12在这些应力的一部分作用下显示出差异。至于Glu-3位点，所有等位基因型组都显示出显著性差异（如表3），特别是Glu-B3位点，它还显示出弛豫时间的差异。
对于麦粒的应力松弛试验的分析（表3）表明两个松弛机制：一个是在在较短的时间，即1-10s(和)，而另一个是在较长的时间，即大约50-450s(和)。很多研究人员使用了不同的设备和不同的研究物质，均提出了类似的弛豫时间，如小麦仁（Figueroa等人。2011A）、大麦籽粒（Bargale和Irudayaraj，1995年）、面筋（Bohlin和Carlson, 1980; Li 等, 2003）、面团（Matsumoto等人，1974年，1975年；Mita和Bohlin，1983年）。Figueroa等人（2011A）提出了13 ％水分含量和17 ％应变的小麦和硬粒小麦内核的压缩数据，即得出弛豫时间、和大约分别是1.5, 12 和111 s。Bargale和Irudayaraj（1995年）则对于约10.1％的水分含量和4％应变的大麦内核，提出了弛豫时间、和大约分别是2.19，7.58和20.8 s。Bohlin和Carlson（1980年）在使用流变仪的情况下表明面团的弛豫时间1-100 s，并在1-500s的变形面筋（Mita and Bohlin, 1983年)条件下致力于面团中的面筋的结构取向。Rao等人（2001年）认为含有较高比例麦谷蛋白的硬粒小麦粉水的更强的面团需要较长的时间（大约42.3s-50.1s）才能达到异松驰阶段，而相比之下一般的面团则要需22.3s-20s才能达到，非常弱的面团只需8.4-11.3s就能达到。Li等人（2003年）认为存在两个松弛过程，即一个是在＜1s，而另一个在10-1000s，这表明面筋的这种行为对应了由于缠结和聚合物的物理交联而成的一个网络结构。有足够的证据表明，聚集在体内的蛋白质（特别是聚集在细胞内的蛋白质）是高度特异性的最佳包装联动生产（低熵）与非共价键聚合（Lindorff-Larsen等人，2011年）。小麦籽粒中的蛋白质可能存在随机取向链。一些水和分子之间的氢键相互作用可以存在。在面团中，蛋白质是在大量分子间的相互作用混合成一个蛋白质网络的过程中由拉力拉伸而成的。然后Li等人（2003年）发表了松弛值的差异。至于面团和那些报道，正如他们在面团中的研究的那样，得出了内核蛋白体的谷蛋白和醇溶蛋白的热力学状态与内核蛋白体的水合和取向的状态。我们通过分析这些样品面团并且使用相同的技术来压缩内核
来继续跟进这项研究。由于这是第一次在直接从完整的麦粒提取出来的HMW和LMW-GS进行应力松弛评估，因次目前的讨论将会局限于本研究中的实验数据。从广义的Maxwell模型的观察表明，应力松弛的差异可以通过HMW和LMW-GS组合应力来解释，虽然其他的参与者不包括在这项研究中的非蛋白聚合物，如戊聚糖和β-葡聚糖作为增塑剂（粘性的行为）和在内核中消耗能量。弛豫时间较短与小SDS沉淀值的空的等位基因和混合时间短有关，而较长的弛豫时间则与SDS的沉降体积和较长的混合时间有关。在HMW-GS和LMW-GS基因当中，我们发现了应力松弛数据的差异，尤其是Glu-3位点和这些与SDS沉降、混合和吹泡仪数据有关的差异。
指数曲线的特点是以弛豫时间（）大约为0.59-1.78s的快速应力衰减区（）。曲线处于第二应力衰减区（）是以弛豫时间（）大约为5.63-11.05s，而曲线处于第三应力衰减区（）是以弛豫时间（）大约为38.24-57.75 S，在弛豫时间（）大约为315.69-439.69后，曲线处于趋于渐近后的水平区间。
应力值在380和600秒之间的差异，在所有的小麦基因组评估为0.5毫米的位移中是非并没有统计学上的显著差异。表3表明，处在弛豫时间为0和12%水分含量的初始应力相对于分别为22.33Mpa的Glu-A1空位点和19.53Mpa的Glu-B3 f位点是较低的，而相对于一些具有良好的质量的位点和基因像34.69Mpa的Glu-A12*位点、33.77Mpa 的Glu-D1 5þ10和34.35 Mpa的Glu-B3h位点是较高的。Figueroa等人认为处于13-20 %的水分含量和位移0.5毫米内的弹性体制的软的部分、面包和硬粒小麦的其相应的初始应力值分别为13.6Mpa、24.1Mpa、24.6Mpa。高应力松弛值有望在超过弹性极限的松弛实验演示出来，正如那些由Haddad等人有关胚乳硬粒小麦的报道那样，他们发现稳定在1000秒的内部应力为34Mpa。Singh等人发现20-16 %的水分含量的凹痕和硬质玉米的最终的应力值在15-20Mpa之间，它与在本研究报告中有相同的水分含量和应变的小麦的应力值完全类似。
3.5. Relationship between relaxation parameters and quality as indicated by SDS-sedimentation and rheological properties
The results of this analysis suggested a linear relationship between some quality properties and stress relaxation data of the grain. There were some significant linear correlation coefficients between the quality and viscoelastic properties. The first decay (s1) was correlated to the mechanical properties of the kernel, and the negative correlation of kernel mechanical properties with s0 and stress s4 with WP indicates that the decay region is mostly affected by plasticizer compounds which can be pentosans, b-glucans. Stress values s2 and relaxation times s2, s3 and s4 showed some relationship to the sedimentation volume and alveograph data. The third term with a range of relaxation times of about 40e60 s had a major contribution to the quality (Table 4).
Rao et al. (2001) also reported similar results in semolina-water dough from durum wheat where the parameters t50 and t75 were correlated with dough mixing properties, extensigraph Rmax/E, alveograph P/L, mixing energy, mixing time and loaf volume. Overall, the characteristic relaxation times (s2, s3, and s4), rather than the stress values themselves, were better discriminators of quality (SDS-sedimentation volume, SDS-sedimentation index, mixing time, alveograph W, and tenacity). The stress values were correlated to the mechanical properties (E, initial stress, force, We and Wp) of the wheat kernels. The characteristic relaxation times s3 (45e60 s) were significantly greater for the high SDS- sedimentation volume and longer mixing times compared to the low SDS-sedimentation and shorter mixing time of alleles with s3 lower than 45 s (Fig. 2). Figueroa et al. (2011a) reported shorter relaxation times for soft wheat compared to bread and durum wheat kernels. As expected, the genotypes with short relaxation and mixing time and low sedimentation volume were samples with Glu-A1 null, and with Glu-B3 j 1B/1R rye-wheat translocation, and with Glu-A3 allele e (null). The genotypes with high sedimentation volume (>17 ml) and mixing time >3.3 min usually had relaxation time s3 > 46 s and good HMW-GS background i.e., Glu-1 1, 2*, 7þ9 or 17þ18 and 5þ10 associated with allelic variants of Glu-3 loci (LMW-GS), i.e., Glu-A3 c and b; Glu-B3 g, h, d.

Fig. 2. (A) SDS-sedimentation volume vs relaxation time s3 (r ¼ 0.44; P 0.01) and (B) Mixing time vs. relaxation time s3 (r ¼ 0.51; P 0.01) of 36 bread wheat lines.
4. Conclusions
The use of the generalized Maxwell model to describe the stress relaxation behaviour of HMW- and LMW-GS in intact wheat kernels was addressed in this work. Thirty-six bread wheat samples representative of a wide range of wheat qualities were studied.
The proposed 4-element generalized Maxwell model fitted the experimental data with R2 >0.9998 and residuals mean square<3.36 10 5 suggesting that it can be used to determine the viscoelastic behaviour of wheat genotypic groups of HMW- and LMW-GS. The relaxation times were given by two distinct contri- butions: the first describes the short time response of the wheat kernel endosperm; the second describes the long time response of the wheat kernel endosperm. Moreover, a significant difference was found between the relaxation times of the investigated alleles of good and poor quality. The relaxation times of 40e60 s were associated with quality parameters and rheological properties of wheat; while shorter relaxation times (1e10 s) were correlated with mechanical properties. Besides moisture content that was kept constant in this research, wheat genotypic group and specific alleles of intact kernels, HMW- and LMW-GS appeared to be predominant factors that affect the relaxation stress constants and relaxation times of the wheat kernel.