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1、第一部分 基因工程实验技术 总论 基因是遗传的基本单位，所以基因工程有时称遗传工程(genetic engnineermg)，有时还称为基因克隆(gene cloning)、分子克隆(molecular cloning)。基因工程的基本技术是DNA重组技术(recombinant DNA technigue)，其定义是在分子水平上，用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外叨割、拼接和重新组合，然后将体外重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。了解这个概念要注意两个问题，第一
2、就是必须有体外DNA的切割、连接、重组过程。第二，DNA重组必须是有目的的，按事先设计的过程进行， 随意的切割、连接、重组过程不是基因工程。 一、DNA体外重组的主要步骤 DNA体外重组可分五个步骡。 (一)目的基因和载体基因的制备 制备带有目的基因的DNA片段和载体基因。 1．带有目的基因的DNA片段的获得 带有目的基因的DNA片段的获得。主要有两个途径：是从已有的生物基因组中分离；是用酶学或化学的方法合成。 从生物基因组中分离DNA片段主要是提取基因组DNA，对3《进行酶切，获得特定的酶切片段。 酶学合成目的基因DNA片段通常是以mRNA为
3、模板，用反转录酶合成其cDNA作为克隆的片段。 化学合成是对目的基因DNA片段在体外进行设计，并用化学方法进行合成，较大的基因一般分多段进行合成，并在体外连接成目的基因的片段。 目前，用聚合酶链反应(PCR)对目的墓因进行扩增或对目的基因转录产物RNA进行RT-PCR扩增，也是获得带有目的基因DNA片段的最常用方法之一(详见第二部分)。 2．载体的选择 DNA体外重组所用的载体是可以克隆DNA片段的DNA分子目前常用的载体类型有：质粒、噬菌休和动物病毒等。其中以质粒载体最常用。 质粒(plasmid)是某些细菌中独立于染色体外的DNA，它有自主复制的能力，
4、在细菌分 裂时可伴随染色体分配到子细胞。它的存在与否，一般说来，对细胞的生存并没有决定性的影响。 根据复制是否受染色体复制功能所控制．质粒可分为严紧型质粒一即每个细菌细胞是 可含l～3个拷贝和松驰型质粒一每个。细菌细胞一般含lo个以上拷贝。 质粒具有不相容性，即在没有选择压力的条件下，两种不同的质粒不能稳定地共存于同 一宿主细胞内。相互不相容的质粒属于同一不相容群；而属于不同的不相容群的质粒则可以 稳定地共存于同一宿主细胞中。 许多质粒本身除作为一个复制子具有复制和调控系统外，还携带一些功能各异并赋予其宿主以不同表型特征的基因，如具有抗生素抗性等。作为一种
5、克隆载体，能提供某种特殊 表型，为其作为载体进行基因操作带来很大方便。 由于天然质粒的这些基本特性，使其可用作克隆的载体，但并不一定是理想的载体。作 为理想载体，它应该具备如下条件： (1)应该具有能自主复制的复制子，并且有能使所携带的外源DNA忠实复制、高效表达 所需的调控系统。 (2)对多种限制性核酸内切酶有单一切点 上。 (3)能够赋予宿主细胞易于检测的表型。 (4)分子量小，多拷贝。 (5)携带外源DNA的幅度较宽。 而且酶切点最好位于易于被检测的表型基因 (6)从生物防护的角度考虑，应当是安全的。
6、 现在已制备了很多符合这些条件的成功载体表1、表2和表3列出了这些载体的基本情况。 表1常用克隆和体外转录载体 载体名称 E.coli 筛选 启动子 单链 测序引物 大小 GenBank 生产厂商** 宿主 标记 名称 DNA (kb) 编号 ColE1 C600 ColE1 6.6 Sig
7、 M13mp(9,18/ JM101 BW M13 M13(F/R) 7.2 BRL,NBS 19,BM20/21)
8、 Pha,USB Pacyc184 RR1 Cm,Tc 4.2 NBL pAT 153 HB101 AP,Tc 3.7 L08853 NBL,NBS pBR332 HB101 AP,Tc
9、 Pst(cw/cw) 4.1 L08654 NBL,NBS Sat(cw/cw) Pha,Pro,USB pBR325 HB101 Ap,Cm,Tc 6 L08855 BRL,NBL,NBS pBR328 HB101 Ap,Cm,Tc
10、 4.9 L08858 Boe,NBL pCF20 DH5α Ap,Tc T7 f1 T7 4.9 USB pEMBL(18, XL-1BLUE Ap,BW f1 4 L-08863-6 Boe 19+/-) pGEM-1/2 JM109
11、 AP SP6,T7 SP6,T7 2.9 Pro pGEM-3/4 JM109 Ap SP6,T7 SP6,T7 2.9 Pro pGEM-3Z JM109 Ap,BW SP6,T7 SP6,T7 2.7 X65304/5 Pro (4Z) pGEM-3Zf
12、 JM109 Ap,BW SP6,T7 f1 SP6,T7 3.2 X65304/7 Pro (+/-) pGEM-5Zf JM109 Ap,BW SP6,T7 f1 SP6,T7 3 X65304/9 Pro (+/-) pGEM-7Zf JM109 Ap,BW SP6,T7 f1 SP6,T7 3.2 X65310/1
13、 Pro (+/-) pGEM-9Zf JM109 Ap,BW SP6,T7 f1 SP6,T7 2.9 X65312 Pro (-) pGEM-11Zf JM109 Ap,BW SP6,T7 f1 SP6,T7 3.2 X65313/4 Pro (+/-) pGEM-13Zf JM109 Ap,BW SP6,T7 f1 SP6,T7 3.2 X
14、65315 Pro (+/-) pMB9 RR1 Tc 5.3 Sig pMOS Blue MOSBlue AP,BW T7 f1 T7 2.9 Ame pPhagescript XL-1Blue BW T3,T7 M13(F/R) 7.3
15、 L08874 Str SK SK,KS, T3,T7 pSHIox-1 E.coli Ap SP6,T7 f1 SP6,T7 3.8 Nov pSL1180(1190) NM522 AP,BW M13 M13(F/R) 3.4 Pha pSP6/T3 E.
16、coli Ap SP6,T3 SP6,T3 2.9 BRL pSP/T7-19 E.coli Ap SP6,T7 SP6,T7 2.9 BRL pSP64 JM109 Ap SP6 SP6 3 X65327 Boe,NBS,Pro pSP64 polyA JM109 A
17、p SP6 SP6 3 X65328 Pro pSP65 JM109 Ap SP6 SP6 3 X65329 Boe,NBS,Pro pSP70 JM109 Ap SP6,T7 SP6,T7 2.4 X65330 Pro pSP71 JM109 Ap
18、 SP6,T7 SP6,T7 2.4 X65531 Pro pSP72 JM109 Ap SP6,T7 SP6,T7 2.5 X65332 Pro pSP73 JM109 Ap SP6,T7 SP6,T7 2.5 X65333 Pro pSPT18 ( JM109 Ap SP6,T7
19、 SP6,T7 3.1 Pro 19,BM 20/21) pT3T7lac JM109 Ap, BW T3,T7 T3,T7 2.7 Boe pT7-0 JM109 Ap T7 T7 4.1 USB pT7-1(2) JM109 Ap T
20、7 T7 2.8 USB pT7T3D JM109 AP T3,T7 f1 M13(F/R) 2.9 Pha T3,T7 pT7Blue Novablue Ap,BW T7 f1 T7 2.9 Nov pT7T318U NM522 Ap,BW T7
21、 f1 M13(F/R) 2.9 L08953 Pha (19U) T3,T7 pTRXN+/- XL-1Blue AP T7 f1 T7, pTRXN 2.9 USB (+/-) pTZ18R,19R NM522 Ap,BW T7 f1 M13(F/R)
22、 NBS,USB,Pha 18U,19U pUR322 DH1 Ap,BW 2.7 L09145 Boe,NBS *表中缩写：Ap，氨苄青霉素；BW,兰/白斑筛选；Cm，氯霉素抗性；ColE1，大肠杆菌素E1免疫性；F/R，正向和反向引物；Pst（cw/ccw）, Pst I顺时针和反时针引物;Sal（cw/ccw）, Sal I顺时针和反时针引物；Tc，四环素抗性 **表中生产厂商名均为缩写。详细名称：Ame,Amersham Inte
23、rnational plc;Apl,Appligene Inc;BRL,GIBCOLaboratoties;Bio,New England Biolabs;Boe,Boehringer Mannheim;Clo,Clontech Laboratories Inc;Inv,Invitrogen Corporation;NBL,NBL,Gene Sciences Ltd;NBS,New Brunswick Sciencntific Ltd;Nov,Novagen Inc;Sig,Chemical Company Ltd;Par,Pharamingen;Pha,Pharmacia Biotech L
24、cd;Str,Stratagene Ltd;USB,USB Corporation. 表2 λ噬菌体和粘粒体 载体名称 类型 宿主 筛 选 启动子 测序引物 表达 大小 GenBank 生产厂商** 标记 名称 方式 (kb) 编号 λ2001 R E.coli spi/P2 43 NBL λBlueMid MI E.c
25、oli AP，BW T3，T7 T3,T7 43 Clo λDASHⅡ MR E.coli spi/P2 T3，T7 T3,T7 41.9 Str λDR2 MI E.coli Ap,Hyg RSV_ DR2 E 45.7 U02428 Clo Human LTR,TK λEMBL3
26、 R E.coli spi/P2 42.2 U02405/53 NBS,Pro,Str λEMBL4 R E.coli spi/P2 42.2 NBS,Pro,Str λEMBL12 R E.coli spi/P2 43 Boe λEXlox(+) MI E.col
27、i Ap SP6.T7. SP6.T7.T7 P.F Nov gene10. λFLXⅡ MR E.coli spi/P2 T3，T7 T3，T7 41.9 Str λGEM-2 MI E.coli SP6.T7 SP6.T7 43.8 Pr
28、o λGEM-4 MI E.coli Ap SP6.T7 SP6.T7 46.2 Pro λGEM-11/12 MR E.coli SP6.T7 SP6.T7 43 Str λgt10 I E.coli clre_ λgt10(F/R) 43.3 Ame,BRL,Boe
29、 pressor Inv,Nbs,Cio Pro λgt11 I E.coli BW λgt10(F/R) P.F 43.7 Ame,BRL,Boe Inv,Nbs,Cio Pro λgt11D I E.coli BW λgt11(F/R) P.F 42.8 Pha λgt11Sfi-Not I E
30、coli BW λgt11(F/R) P.F 43.7 Pro λgt18/19 I E.coli BW λgt11(F/R) P.F 43.2 λgt20/21 I E.coli BW λgt11(F/R) P.F 42.7 λgt22/23 I E.coli BW λgt11(F/R) P.F 42.7 λgt22A
31、 MI E.coli BW SP6.T7 λgt11(F/R) P.F 42.8 BRL SP6.T7 λgtWES, λb I E.coli 40.3 BRL λMax1 MI E.coli Ap.ura3 T7 T7 E 43.
32、9 Clo Yeast GAL1. 10 λMOSSlox MI E.coli Ap SP6.T7 SP6.T7.T7 P.F 42.7 M54945 Ame gene10 λMOSSlox MI E.coli Ap
33、 SP6.T7 SP6.T7 42.8 Ame λPOP6 MI E.coli, Ap,Hyg, RSV- E Inv mam. Cl.rep LTR. -ressor TK λSHlox-1 MI E.coli Ap SP6.T7 SP6.T7
34、 M37056 Nov λYES MI E.coli, Ap.ura3 lac,GAL1 E 47.8 Clo yeast. λZAPⅡ MI E.coli Ap,BW T3，T7 M13(F/R) P.F 40.8 Str lac SK,KS,
35、 T3，T7 pHC79 C E.coli Ap,Tc 6.5 Boe,BRL,NBS pWE15 C E.coli Ap,nco T3，T7 T3，T7 8.2 Clo pWE16 C E.coli Ap,dHfr T3，T7 T3，T7 8.2
36、 Clo SuperCos C E.coli Ap,nco T3，T7 T3，T7 7.6 Str mam. SV40 *表中缩写.详细含义表1注解中已列的不再重复，其余为：C.粘粒;dHfr.二氢叶酸还原酶;E.真核生物表达；F．融合蛋白；GAL1.酵母半乳糖激酶；Hyg.潮酶素B抗性（hph基因）; I．插入载体；lac.lac启动子；LTR．长末端重复序列；mam．哺乳动物细胞；MI．多功能插入载体；M
37、R．多功能替换载体(multifunctional replacement vector)；neo,neo基因；原 核生物表达；R．替换载体（replacement vector）；RSV．Rous肉瘤病毒；TK，胸苷激酶基因；ura.ura3基因。 * *：表中生产名厂商名均为缩写，详细名称见表1注解。 表3 表达载体* 载体名称 宿主 筛选 启动子 测序引物 表达 大小 GenBank 生产厂商** 标记 名称 方式 (kb) 编号 pA
38、X4abc +/- E.coli Ap lac pAX1/2 P.F 6.2 USB pAX5+/- pBC SK(+/-) E.coli Cm.BW T3.T7 T3.T7 P.F 3.4 Str [KS(+/-)] pBluescriptⅡ Ks E.coli Ap.BW T3.T7 M13(F/R).SK. P.F 3 Str +/-(SK+/
39、) KS.T3.T7 pBS(+/-) E.coli Ap.BW T3.T7 M13(F/R).T3. P.F 3.2 L08782/3 Str T7 PBTac1(2) E.coli Ap.Tc tac P 4.6 Boe PBtrp2 E.coli A
40、p.Tc trp P 5.2 Boe pCDM8 E.coli T7.CMV T7.pCDM8R E 4.4 Clo.Inv mam. pcDNA1 E.coli SP6.T7. SP6.T7 E 4 Inv mam CMV pcDNAⅡ E.co
41、li Ap.BW SP6.T7 M13(F/R).SP6.P.F 3 Inv lac T7 pcDNA3.1 E.coli Ap.neo SP6.T7 SP6.T7 E 5.4 Inv mam CMV pcDNA1/Amp E.coli Ap SP6.T7 SP6.T7 E
42、 5.4 Inv mam pCDV1 E.coli Ap SV40 E 3.1 Pha mam pCITE E.coli Ap T3.T7 M13(F/R).T3. P.F 3.8 Nov T7.CITE pDR2 E.coli Ap.Hyg RSV
43、 EBV(R) E 10.7 U02428 Clo Human PDR540 E.coli Ap tac P 4.1 Pha PEBVHis A.B.C E.coli Ap.Hyg TK.RSV EBV(R) E 10.3 Inv Mam PET E.coli Ap.Km T7.lac
44、 P.F 5 Nov pEUK-C1 E.coli Ap SV40 E 4.9 U02429 Clo mam pEX1.2.3 E.coli Ap λPr P.F 5.8 Boe pEXlox(+) E.coli Ap SP6.T7 PMF 4
45、 Nov pEZZ18 E.coli Ap spa.lac M13(F) P.F 4.6 M74186 Pha pGEMEX-1(-2) E.coli Ap SP6.T3 SP6.T3.T7 P.F 4 X65317/8 Pro gene 10 pGEX tector E.coli Ap tac P.F 4.9 Pha pKK223-3
46、 E.coli Ap tac P 4.6 M77749 Pha pKK233-2 E.coli Ap tac P 4.6 U02438 Clo pKK388-1 E.coli Ap.Tc tac P 5.1 U02444 Clo pMAL-p2 E.coli Ap.Bw tac
47、 malE P.F 6.7 Bio pMAM E.coli Ap,gpt MMTV- E 7.6 U02432 Clo mam. LTR pMAMneo E.coli Ap,neo MMTV- E 8.4 U02443 Clo
48、 mam. LTR. pMC1871 E.coli Tc RSV_ M13(F) P.E 7.5 Pha LTR Pmex5/6/7/8 E.coli Ap tac pMEX(F/R) P 3.6 USB pMSG E.coli Ap,ght NMTV
49、 E 7.6 Pha mam. pNH16a E.coli Ap lac P NBL,Str pNH8a,18a,46a E.coli Ap lac,tac P NBL,Str pPL-lambda E.coli Ap λPL
50、 P 5.2 Pha pRc/CMV E.coli Ap,neo SP6.T7, SP6.T7 E 5.5 Inv mam. CMV pRc/RSV E.coli Ap,neo RSV E 5.2 Inv mam. pREP
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