酵母菌液体发酵生产β-半乳糖苷酶的研究正文.docx

引言
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23 β-galactosidase)，又称乳糖酶(Lactose)，广泛存在于各种动物、植物及微生物中，是一种白色粉末，无味，溶解后是一种浅棕色液体。乳糖酶位于小肠空肠段黏膜上皮细胞的刷状缘，催化β-半乳糖苷类化合物中β-半乳糖苷键，使其发生水解断裂，乳汁中的乳糖只有经乳糖酶的催化水解为葡萄糖和半乳糖后，才能被小肠吸收。除能使乳糖分解生成半乳糖和葡萄糖外，还具有转半乳糖苷的作用。大量研究表明哺乳动物的乳糖酶活性随年龄的增长，具有典型的生理性降低，成人乳糖酶下降的不可逆受基因控制。全世界乳糖酶缺乏的发生率在50%以上，而我国有90%左右成人缺乏乳糖酶。若乳糖酶缺乏者一次摄入较多乳糖，乳糖未能及时被消化吸收，引起医学上的乳糖不耐受症(lactose intolerance)，其解决途径之一是采用外源性乳糖酶替补疗法[1，2]。我国人口属乳糖酶缺乏的高发群体，由于乳糖酶的缺乏，对利用乳品作为廉价的动物蛋白及钙的来源以改善人群的营养状况造成困难。为弥补肠道乳糖酶的不足，可采用微生物来源的乳糖酶预处理乳品生产低乳糖食品[3-5]。利用乳糖酶水解乳糖的性质降低乳制品的乳糖含量，开发更易于被人体吸收、被更多的消费群体所适用的低乳糖系列奶制品已成为乳品行业的新亮点。但是众多因素诸如制备酶的过程中酶活力的损失、生产工艺复杂、产量低等制约了乳糖酶在生产中的应用其中很重要一点是成本太高。因而很多学者在构建高效生产乳糖酶的菌株，筛选酶学性质更为优良的乳糖酶，培养基的优化等方面做了大量研究。
随着科学技术的发展，乳糖酶的作用被研究得更加透彻，现已在许多方面被应用：(1)在乳品工业中的应用。乳糖酶除了可以减轻乳糖不耐症症状外，还可以改善乳制品的外观和口感，避免乳糖在炼乳中结晶，并能增加炼乳的甜度；还可以催化乳糖水解过程中产生的半乳糖基转移至乳糖等受体上，形成低聚半乳糖。低聚半乳糖甜度低，对酸、热稳定，具有抗淀粉回生等理化特性，低聚半乳糖还具有非致龋齿性、非消化性（具有膳食纤维的生理功能）、产热能低、促进双歧杆菌增殖等优异的生理学特性。因此，低聚半乳糖作为一种新型的功能性食品配料应用前景广阔[6]。此外用乳糖酶水解乳糖因条件温和，不会引起蛋白质变性、褐变反应和其他副反应，常用来制造乳糖水解乳、乳清糖浆和半乳糖葡萄糖浆。乳糖水解乳中乳糖含量降低70%～80%，可以很好的解决乳糖不耐受问题；用于制造酸乳可以缩短凝固时间、延长酸乳货架寿命；用于加工干酪，不仅缩短乳酪凝固时间，而且乳酷凝固坚实，减少乳酪澄清造成的损失；生产浓缩乳时添加25%～30%乳糖水解乳，可以防止结晶现象，增加产品甜度，减少蔗糖用量；乳清糖浆可代替卵蛋白和蔗糖，用于食品加工，使产品风味和外观大大改善。半乳糖葡萄糖浆主要代替蔗糖作甜味剂；(2)在果蔬加工方面的应用。研究发现β-半乳糖苷酶具有合成或修饰其它碳水化合物以及促进果蔬软化和成熟的功能。乳糖酶普遍存在于各种植物中，了解它在果蔬各个生长时期的含量对于果蔬的成熟、风味、颜色及采收后加工都有重要意义。一般在植物成熟期β-半乳糖苷酶含量增加，它降解含半乳糖苷的胞壁多糖，释放游离的半乳糖。可溶性的半乳糖能促进胡椒成熟，对番茄能促发乙烯加快成熟。β-半乳糖苷酶已用于梨、苹果、土豆和中国水粟的软化和番茄、胡椒、甜瓜、樱桃、核果和牛油果的成熟；(3)在分析检测方面的应用。食品中乳糖含量的分析，将精制的β-半乳糖苷酶和其它酶(如过氧化物酶、葡萄糖氧化酶)联合使用可以分析冰淇淋、干酪和含牛乳的干制品中的乳糖含量。该法简便快捷，费用低廉，又可以在样品不除去蛋白的情况下使用，适合于在食品工业上进行应用。免疫学方面，将β-半乳糖苷酶与人体胞外淀粉状蛋白前体融合形成融合蛋白，可作为Alzheimer病的免疫源，并进一步制备其单克隆抗体。还有报道将β-半乳糖苷酶作为一种辅蛋白，用来稳定和增加UR5-UR1融合蛋白的溶解性，以此作为猫白血病毒gp70的疫苗。在疾病诊断方面，将抗菌性HIV病毒基因与β-半乳糖苷酶基因LacZ重组后作为诱导基因在COS细胞中产HIV-LacZ缺陷型病毒，最后在CD4+靶细胞中表达β-半乳糖苷酶。用这一系统抑制HIV的早期翻译，并预测化合物抗HIV的活性[7,8]。在环境检测方面，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶活性检测可快速分析浴场和渔场地区海水水体受排泄物污染程度[9]；(4)在医药方面的应用。β-半乳糖苷酶是酶类药物，适用于婴儿各种消化不良症，如先天性乳糖酶缺乏症、由胃障碍及缺铁所致的幼儿慢性腹泻、幼儿及新生儿腹泻，由感冒及消化不良等引起的继发性腹泻；治疗哺乳仔猪腹泻，哺乳仔猪发育障碍和体能消耗的主要原因是腹泻。许多报道认为仔猪腹泻是由微生物感染引起的，也有报道认为是由消化不良所致。当存在于小肠粘膜绒毛的β-半乳糖苷酶发生先天基因缺陷时或后天障碍，则发生乳糖消化不良性腹泻，其特征是粪便中水分、乳糖量和乳酸量增加、pH值降低等[10]。
由于β-半乳糖苷酶的作用越来越重要，为了将其实现工业化，人们做了大量的研究。β-半乳糖苷酶广泛存在于各种动物、植物及微生物中，但由于微生物的快速生长和高效代谢的生物学特性，使其成为工业化酶制剂的主要来源。利用微生物发酵法制取β-半乳糖苷酶、酶源丰富、产量高、 生产成本低、周期短，而且不受季节、地理位置等因素的影响。微生物生产β-半乳糖苷酶包括：(1)细菌β-半乳糖苷酶，尤其是嗜热细菌产生的酶正得到广泛的研究。到目前为止，大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶研究得最彻底、最深入，并已大量用于生化分析中。细菌产生的β-半乳糖苷酶是胞内酶，在培养过程中不能分泌到培养基中，它的耐热性较高，这一点有利于固定化酶的制造。但因产量低及可能的毒性问题，迄今未用于工业化生产；2)霉菌产生的β-半乳糖苷酶是胞外酶，可以用固态培养，也可以采用液态深层培养来生产。在培养过程中，酶分泌到培养基中，提取较为方便。霉菌产生的β-半乳糖苷酶较耐热、耐酸，不需要活化剂和稳定剂，稳定性较高。目前应用较多的霉菌β-半乳糖苷酶产生菌主要是米曲霉(Aspergillus) 和黑曲霉(Aspergillus niger)，但其生长周期比酵母菌较长；(3)酵母菌是一类在食品医药工业中应用已久的微生物种群，酵母菌产生的β-半乳糖苷酶通常是胞内酶，制备纯品必须破碎细胞。该酶对酸、热较不稳定，当某些离子存在时，才有最大活性，因此不适于在工业上进行应用。但是，酵母菌容易培养，在深层培养条件下可以大量生成β-半乳糖苷酶，这些优点掩盖了它的不足，故酵母菌产生的β-半乳糖苷酶才得以成功地进行开发[11-13]。酵母菌中有乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)。
随着酶学研究的不断深入和酶工程的发展，工业化生产的酶越来越多，酶的应用越来越广泛。但在酶的使用过程中，人们也注意到酶的一些不足之处。例如：（1）酶的稳定性差，在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活；（2）酶一般都是在水溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反映结束后，即使酶仍有较高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使成本较高，而且难于连续化生产；（3）酶反应后成为杂质与产物和混合在一起，无疑给进一步的分离纯化带来一定的困难。为此，人们针对酶的不足之处寻求其改善方法。其方法之一就是固定化酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有增加酶稳定性、可重复使用、易与反应物分离等特点[14]。固定化乳糖酶对于大规模工业生产来说，虽然游离的乳糖酶水解乳糖工艺简单，但是因为添加乳糖酶会使牛奶掺入外来蛋白质，另外乳糖不耐受症患者又不喜欢乳糖酶分解乳糖后导致甜味增加，而固定化酶则可以避免以上问题。固定化酶是指在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。固定化方法很多，主要有吸附法包埋法、结合法、交联法和热处理等方法[11]。虽然对于固定化乳糖酶水解体系已有很多研究，但只有很少一部分应用被放大，更少达到工业化或半工业化水平。鉴于这种状况，还需解决以下问题，以使固定化乳糖酶体系用于实际生产。(1)筛选和培育活力高、耐热性较高的乳糖酶及微生物；(2)开发无毒性、机械强度高的载体；(3)酶活高、半衰期长的固定化方法的开发；(4)反应器的清洗和杀菌方法的开发；(5)扩大酶的应用领域，寻求新的调制方法，如东北农业大学应用透性化乳糖酶固定于中空纤维膜反应器上，活力回收率达到99.9%，半衰期为859.2h，具有工业化的应用价值。
随着我国经济的快速增长，牛奶及其它乳制品被越来越多的人作为主流早餐。乳糖酶缺乏和乳糖不耐受影响着世界不同地区、不同种族的人们对乳制品的摄人，发生率为30%～100%。在西方国家，乳制品摄入量较高，乳糖消化吸收和营养作用受到高度重视，乳糖酶缺乏和不耐受的宣传非常广泛；在我国，随着生活水平的提高和乳制品摄入量的提高，这一问题刚刚引起人们的重视。虽然人们已经认识到牛奶是最完美的天然饮食，但是却有很多人因为体内缺乏乳糖酶而不能充分利用它，乳糖酶的出现使这一问题迎刃而解，乳糖酶在乳品工业中愈来愈多的使用也正说明了这一点[15]。迄今为止，我国乳制品工业使用的乳糖酶全部依赖进口，且价格昂贵，为了使我国乳品工业能蓬勃发展，使更多的人享受到奶制品的天然营养；开发高质量的乳糖酶已经成为刻不容缓的事实。随着人们对乳制品营养作用以及乳糖酶研究的加深，相信在不久的将来，乳糖不耐受将不再成为困扰，牛奶也会更广泛的为人所用。生物技术的发展使生产的β-半乳糖苷酶纯度更高、活性更强，更利于生产上实际操作。对其反应机制，动力学行为的深层研究，使此酶的应用不再仅仅限于乳糖水解，广泛应用在食品、医药、免疫、环境检测等各个领域。也由于近20年来基因工程、酶工程、蛋白工程的迅猛发展，对编码此酶的基因及其表达调控在分子水平上做了大量深入研究，如重组基因、融合蛋白等，反过来也促进了生物技术诸多领域的发展。
本文旨在通过摇瓶培养法，确定乳酸克鲁维酵母(K. lactis)液体发酵生产β-半乳糖苷酶适宜的培养基和发酵条件，为工业化生产提供参考依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌种 乳酸克鲁维酵母（K. lactis）购于中国工业菌种保藏中心。
1.1.2培养基 主要有以下几种:母种培养基[4]（乳糖2.0%，酵母抽提物0.35%，琼脂2.0%，pH7.5）；液体种培养基[4]（乳糖2.0%，酵母抽提物0.35%，蛋白胨0.35%，pH7.5）；基础发酵培养基[4]（乳糖8.0%，酵母抽提物0.35%，蛋白胨0.35%，NaCl 0.01%，MnCl2 0.01%，pH7.5）
1.1.3 溶液的制备 主要有以下几种：3,5-二硝基水杨酸溶液(DNS)的制备 称取3,5-二硝基水杨酸0.63g于50mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后加入2mol/L NaOH溶液26.2mL，再加入到50mL含有18.5 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加0.5g结晶酚和0.5gNa2SO3搅拌溶解，冷却后移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，在超声波洗脱仪震荡20min，贮于棕色瓶中备用；0.1mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲液的制备 称取KH2PO43.4g，溶于少量水中，和145.5mL 0.1mol/L的NaOH溶液一起加入到500mL的容量瓶中，然后用蒸馏水定容到500mL；250mg/mL的乳糖溶液的制备 称取25g乳糖用0.1mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解并定容到100mL，即得。
1.1.4 主要仪器 超声波细胞粉碎机（JY98-Ⅲ型，上海新芝生物技术研究所）；722N可见分光光度计（7070511012型，上海精密科学仪器有限公司）；低温超高速离心机（3K3D型，SIGMA）；双层小容量全温度恒温培养振荡器（ZHWY-2102C，上海智城分析仪器制造有限公司）等。
1.2 方法
1.2.1酶的制备
1.2.1.1液体种的制备 将菌种接种到母种培养基中，30℃培养20h。再将其接种到液体种培养基中，30℃、160r/min培养20h。
1.2.1.2 液体发酵 制备基础发酵培养基，100mL的三角瓶装液量40mL，于121.3℃灭菌30min，冷却后按2.5%的接种量接种，摇床转速160r/min，发酵培养20h。
1.2.1.3 酶液的制备 取10mL菌液于50mL离心管中，4℃，4000r/min离心10min，弃去上清液，菌沉淀用0.1mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤2次，最后加入10mL缓冲液重悬。该菌悬液用超声波处理（超声破碎仪的功率为500W，间歇式工作，工作6S，间歇3S，破碎次数20次）后，细胞破碎液4℃，8000r/min离心10min，收集上清液[16,17]。
1.2.2 酶活力测定
1.2.2.1葡萄糖标准溶液的制备 将葡萄糖放在110℃烘箱中烘2h至恒重，称取0.1080g烘好的葡萄糖，溶解并定容至100mL。
1.2.2.2 葡萄糖标准曲线绘制 取16支具塞试管，依次编号为0，1，2，3，4，5，6，7，并作平行实验，见表1.1。
表1.1 葡萄糖标准曲线绘制方法
Table 1.1 Glucose standard curve method of drawing
管号
0
1
2
3
4
5
6
7
葡萄糖量(ml)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
蒸馏水(ml)
7
6.5
6
5.5
5
4.5
4
3.5
DNS(ml)
2
2
2

2
2
2
2
2
将上述溶液加入试管摇匀后置于沸水浴中加热5 min后，冷却定容至25mL。摇匀后以0号管为对照于520nm处测定OD值，以葡萄糖含量μmol为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，见图1.1。

图1.1 葡萄糖标准曲线
Fig.1.1 Glucose standard curve
1.2.2.3 酶活性的测定 取2mL质量浓度为250mg/mL的乳糖溶液加入试管中，将试管浸入（40±1）℃恒温水浴中预热5min后，加入1mL酶液于60℃反应30min，立即取出，置于沸水浴中灭活10min，冷却至室温，用3mLDNS试剂显色，测OD值(520nm) [18]。
酶活力计算 从标准曲线中查出葡萄糖μmol数；
酶活力(u/mL)=葡萄糖量/（30*Ew）
其中：30为保温时间(酶与底物作用时间，min)；
Ew为酶液的体积(mL)；
u是指在特定条件下，每分钟催化乳糖水解成1μmol葡萄糖的酶量。
1.2.3 菌体浓度测定 取培养液10mL，6000r/min离心15 min，收集菌体，用无离子水洗涤，然后加3倍无离子水稀释，以无离子水为空白，于590nm处测定吸光度(A)。
2 结果与分析
2.1 液体发酵培养基的筛选试验
2.1.1 不同碳源对β-半乳糖苷酶活性的影响 在基础发酵培养基中，分别以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖可溶性淀粉代替乳糖为碳源，进行实验，每组重复6次，测定不同碳源对β-半乳糖苷酶活性的影响，结果见表2.1。
表2.1 不同碳源对β-半乳糖苷酶活性的影响
Table 2.1 Effect of different carbon sources on the activity of β-galactosidase by K.lactis
碳源
乳糖
葡萄糖
蔗糖
麦芽糖
可溶性淀粉
β-半乳糖苷酶活性
0.2975
0.2818
0.2219
0.2597
0.2649
表2.1结果表明，以乳糖作碳源时得到的β-半乳糖苷酶活性最高，为0.2975u/ml，葡萄糖麦芽糖和可溶性淀粉次之，蔗糖作碳源时得到的β-半乳糖苷酶活性最低。综合不同碳源对β-半乳糖苷酶活性的影响，以乳糖为最适碳源。
2.1.2 不同氮源对β-半乳糖苷酶活性的影响 在基础发酵培养基中，分别以尿素、黄豆粉、水解乳蛋白代替蛋白胨为氮源，进行实验，每组重复6次，测定不同氮源对β-半乳糖苷酶活性的影响，结果见表2.2。
表2.2 不同氮源对β-半乳糖苷酶活性的影响
Table 2.2 Effect of different nitrogen sources on the activity of β-galactosidase by K.lactis
氮源
蛋白胨
尿素
黄豆粉
水解乳蛋白
β-半乳糖苷酶活性
0.2963
0.2826
0.2569
0.2050
表2.2结果表明，以蛋白胨作氮源时得到的β-半乳糖苷酶活性最高，为0.2963u/ml，尿素和黄豆粉次之，而水解乳蛋白作氮源得到的β-半乳糖苷酶活性最低。综合不同氮源对β-半乳糖苷酶活性的影响，以蛋白胨为最适氮源。
2.1.3 培养基成分的优化试验 以乳糖为碳源，蛋白胨为氮源，添加NaCl，MnCl2 和0.35％酵母抽提物进行L9 (34)正交试验，见表2.3。实验结果见表2.4。
表2.3 正交试验因子水平表
Table 2.3 The different level and factors
因子
乳糖(w/v ,%)
A
蛋白胨(w/v ,%）
B
NaCl(w/v ,%)
C
MnCl2(w/v ,%)
D
水平1
8
1.05
0.03
0.03
水平2
4
0.70
0.02
0.02
水平3
2
0.35
0.01
0.01

表2.4 L9(34)正交试验方差分析
Table 2.4 The analysis of result with orthogonal test of L9(34)
编号
乳糖
A
蛋白胨
B
NaCl
C
MnCl2
D
酶活性(u/ml)
1
1
1
1
1
0.2416
2
1
2
2
2
0.2592
3
1
3
3
3
0.2782
4
2
1
2
3
0.2303
5
2
2
3
1
0.2255
6
2
3
1
2
0.2142
7
3
1
3
2
0.2191
8
3
2
1
3
0.2094
9
3
3
2
1
0.1901
K1
0.779
0.691
0.6652
0.6572

K2
0.67
0.6941
0.6796
0.6925

K3
0.6186
0.6825
0.7228

0.7179

k1
0.2583
0.2303
0.2217
0.2191

k2
0.2233
0.2314
0.2265
0.2308

k3
0.2062
0.2275
0.2409
0.2393

R
0.0521
0.0039
0.0192
0.0202

根据极差分析，比较得到的β-半乳糖苷酶活性，影响β-半乳糖苷酶活性的大小关系是A＞D＞C＞B，各因子最佳水平组合是A1 D3 C3B2 ，所以最佳培养基的配比是乳糖8%、蛋白胨0.7%、NaCl 0.01%、MnCl2 0.01%、酵母抽提物0.35%。
2.2 发酵条件的优化试验
2.2.1 初始pH对β-半乳糖苷酶活性的影响 将初始pH分别调为 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0, 30℃，160r/min振荡培养20h，测定初始pH对β-半乳糖苷酶活性的影响，结果见表2.5。
表2.5 初始pH对β-半乳糖苷酶活性的影响
Table 2.5 initial pH effect on the activity of β-galactosidase by K.lactis
pH
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
β-半乳糖苷酶活性
0.2034
0.2207
0.2355
0.2496
0.2790
0.2392
表2.5结果表明，不同初始pH对发酵产生的β-半乳糖苷酶活性有明显的影响。初始pH从5.5到7.5，发酵产生的β-半乳糖苷酶的活性依次增大，超过7.5后活性下降。因此，确定乳酸克鲁维酵母(K.lactis)液体发酵生产β-半乳糖苷酶的最适pH范围是7.0～7.5。
2.2.2 培养温度对β-半乳糖苷酶活性的影响 选择24℃，26℃，28℃，30℃，32℃发酵温度，初始pH为7.5，160r/min振荡培养20h，测定培养温度对β-半乳糖苷酶活性的影响，结果见表2.6。

表2.6 培养温度对β-半乳糖苷酶活性的影响
Table 2.6 The temperature of fermentation effect on the activity of β-galactosidase by K.lactis
温度（℃）
24
26
28
30
32
β-半乳糖苷酶活性
0.1764
0.1945
0.2175
0.2271
0.2247
表2.6结果表明，不同培养温度对发酵产生的β-半乳糖苷酶活性有明显的影响。温度从24℃到30℃，发酵产生的β-半乳糖苷酶的活性依次增大，超过30℃后活性下降。培养温度为30℃时，发酵产生的β-半乳糖苷酶的活性最高，为0.2271u/mL。因此，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)液体发酵生产β-半乳糖苷酶的最适温度为30℃。
2.2.3 振荡速度对β-半乳糖苷酶活性的影响 选择160，180，200，220的振荡速度，初始pH为7.5，30℃，振荡培养20h，测定振荡速度对β-半乳糖苷酶活性的影响，结果见表2.7。
表2.7 振荡速度对β-半乳糖苷酶活性的影响
Table 2.7 The stirred speed effect on the activity of β-galactosidase by K.lactis
转速（r/min）
160
180
200
220
β-半乳糖苷酶活性
0.2215
0.2544
0.2609
0.2327
表2.7结果表明，不同振荡速度对发酵产生的β-半乳糖苷酶活性有明显的影响。随着振荡速度的升高，发酵产生的β-半乳糖苷酶活性增加明显，在180～200 r/min时，发酵产生的β-半乳糖苷酶活性维持在一个相对较高的水平，但转速达220r/min时，发酵产生的β-半乳糖苷酶活性开始降低。但根据酵母菌的生长规律，在转速达220r/min时，摇瓶中的溶氧量增加，发酵产生的β-半乳糖苷酶活性应高于在转速为200r/min时的，可能的原因是转速为220r/min时，菌体生长速度高于在其它转速下的，在培养20h后，菌体已生长缓慢，进入衰亡期。因此，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)液体发酵生产β-半乳糖苷酶的最适振荡速度范围是180～200 r/min。
2.2.4 培养时间对β-半乳糖苷酶活性的影响 选择16，18，20，22，24，26h的培养时间，初始pH为7.5，30℃，200r/min振荡培养，测定培养时间对β-半乳糖苷酶活性的影响，结果见表2.8。
表2.8 培养时间对β-半乳糖苷酶活性的影响
Table 2.8 The time of fermentation effect on the activity of β-galactosidase by K.lactis
发酵时间
16
18
20
22
24
26
β-半乳糖苷酶活性
0.2287
0.2452
0.2625
0.2416
0.2179
0.2050
表2.8结果表明，不同培养时间对发酵产生的β-半乳糖苷酶活性有明显的影响。培养时间从0到20h，发酵产生的β-半乳糖苷酶的活性依次增大，当发酵时间达到20h时，发酵生产β-半乳糖苷酶的活性最高，为0.2625u/mL。以后随着时间的增加，发酵生产β-半乳糖苷酶的活性开始缓慢下降。因此，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)液体发酵生产β-半乳糖苷酶的最佳培养时间是20h。
2.3 菌体生长与产酶曲线
采用摇瓶培养法，在最佳培养基的配比是乳糖8%、蛋白胨0.7%、NaCl 0.01%、MnCl2 0.01%、酵母抽提物0.35%，培养条件为初始pH值为7.5，培养温度30℃，振荡速度为200r/min，进行乳酸克鲁维酵母(K.lactis)液体发酵生产β-半乳糖苷酶实验，测定菌体生长及产酶曲线，分析乳酸克鲁维酵母的菌体生长规律和产酶规律，结果见图2.1。

图2.1 菌体生长及产酶曲线
Fig.2.1 Growth and enzyme production curve for Kluyveromyces lactis
结果表明，0～16h为对数生长期，菌体浓度迅速增大，16h后进入稳定期；β-半乳糖苷酶从14h开始大量表达，在20h达到最大，以后随时间延长呈下降趋势。原因是细胞衰老并发生自溶，细胞数目减少，酶活降低。因此，在保持较高菌体浓度与产酶量的情况下，确定液体发酵时间为20h。
3 小 结
（1）乳酸克鲁维酵母(K.lactis)对供试碳源都有不同程度的利用，但以乳糖的利用率最高。其对蛋白胨的利用率高于其它氮源，但在工业中，可以稍稍加大尿素的比例，就能替代蛋白胨，从而减少生产成本。正交实验确定的最适发酵培养基为：乳糖8％，蛋白胨0.7%，酵母抽提物0.35％，NaCl 0.01%， MnCl2 0.01%；
（2）乳酸克鲁维酵母(K.lactis)液体发酵β-半乳糖苷酶的最适pH7.0～7.5，最适振荡速度180～200r/min，最适培养温度30℃，最适培养时间20h。

致 谢 本毕业设计的顺利完成，感谢周建军老师、刘开辉老师、冯自立老师和张涛老师的帮助,同时也感谢在实验过程为我提供帮助的同学。

参 考 文 献
[1] 王敏,檀建新,张伟,等.乳糖酶的应用及发展现状[J].食品与发酵工业,2003,11(29):89－92.
[2] 张红艳,刘成更,赵文娟,等.乳糖酶的酶学特性及其研究进展[J].食品研究与开发,2004,6(25):34－36.
[3] 李玉强,王昌禄,顾小波,等.β-半乳糖苷酶的研究与应用[J].中国食品添加剂,2001(2):30－33.
[4] 王逢,袁勤生,徐康森.产乳糖酶酵母Kluyveromyces marxianus发酵条件的研究[J].中国医药工业杂志, 2004,10(35):587－589.
[5] 周震,邱蔚然,闫蓬勃.产核酸和乳糖酶的热带假丝酵母QZN0209培养条件研究[J].工业微生物,2002,32(3):28－32.
[6] 刘建福,王璋,许时婴. Kluyveromyces fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶的摇瓶培养条件[J].无锡轻工大学学报, 2004, 23(4):82－86.
[7] Mark Murphy, Ursula Greferathand Yvette M. Wilson. A method for detecting functional activity related expression in gross brain regions, specific brain nuclei and individual neuronal cell bodies and their projections circuits and regions in the brain [J].Biol.Proced.Online,2006,9(1):1－8.
[8] Malcolm J.Casadaban and Joany Chou.In vivo formation of gene fusion encoding hybrid βgalactosidase proteins in one step with a transposable Mu-lac transducing phage[J].1984(81):535－539.
[9] 秦燕,宁正祥,胡新宇.β-半乳糖苷酶的应用研究进展[J].沈阳农业大学学报,2000,31(6):595－599.
[10] 关荣发,许梓荣.β-半乳糖苷酶在动物营养中的应用[J].饲料博览,2002(7):10－11.
[11] 王敏.微生物乳糖酶在食品工业中的发展现状及应用[J].衡水师专学报,2003,5(4):42－44.
[12] 卜建斌,云战友,邢黎明.β-半乳糖苷酶的应用及固定化[J].农产品加工学刊,2006(2):4－7.
[13] 王敏,檀建新,张伟.微生物乳糖酶的特性和发展现状[J].河北农业大学学报,2003(26):167－169.
[14] 郭勇 主编.酶工程[M].中国轻工业出版社,2002版,149－158.
[15] 李燕,刘庆军,王锦,等.乳糖酶的固定化及应用[J].山东轻工业学院学报(自然科学版),2003,17(3):52－56.
[16] 万其兵,刘丽丽,杨秀英.真菌细胞破壁方法的研究[J].天津师范大学学报(自然科学版),2004,24(4):8－40.
[17] 刘建福,王璋,许时婴.碳源对K.fragilis LFS-8611β-D-半乳糖苷酶合成的影响[J].工业微生物,2004,34(3):24－27.
[18] 赵玉萍,杨娟.四种纤维素酶酶活测定方法的比较[J].食品研究与开发,2006,27(3):116－118