蛋白的纯化.doc

第二部分：蛋白的纯化

如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？

破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。

根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后， 菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成 的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个
PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。

对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。

沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。
取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。
无 论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。

包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。

电泳检测的话，可以用SDSPAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。

包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体；
建议：
还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。

包涵体的纯化（一）

对于表达在包涵体内的蛋白，可以通过降低诱导温度（可以试试4度诱导过夜）和IPTG的量，降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量等来使目的蛋白不表达在包涵体内达到可溶性表达。但一般用pET28作为表达质粒且蛋白表达量较大时易形成包涵体。

包涵体：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
包涵体的组成与特性：
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

包涵体表达的有利因素：
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。

菌体破碎一般采用：
a 超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施（超声时置于冰上），超声功率、超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮(5-10分钟)。
b反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
c化学处理法: 细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理.
l 必要时可将三种方法结合起来使用以使菌体充分破碎

在这我们以100 ml菌液为例：（此纯化方法可于室温中进行）
诱导表达
1 挑取含有重组质粒的菌落，接种于5 ml加有相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2 以1％的接种量转接到100 ml加有相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6－1.0，先取出300 μl诱导前的菌液，作为对照。再向锥形瓶中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养3－4 h。
3 取300μl经诱导后的菌液于EP管中，连同诱导前的菌液一起12,000 rpm离心1min后，将上清置于一个新的Eppendorf管中，细胞沉淀用等同于上清体积的ddH2O悬浮，分别制样。（以80μl样品为例，需加20μl 4×loading buffer，8μl 1M的DTT，52μl上清或沉淀悬浮液）

Ni2+亲和柱的制备
1 颠倒混匀固化的Ni2+树脂，取1ml装入层析柱。树脂自然沉降。
2 用3倍柱体积无菌水冲洗树脂。
3 用6倍柱体积1X Binding Buffer（包含6 M 尿素）洗柱，放置待用（4℃）。

包涵体纯化 （参照Novagen的纯化protocol）
1 以10,000 × g 离心10 min收菌后去上清。重悬菌体于40 ml 1X Binding Buffer 。
2 超声破碎细胞至菌液应该变清亮。
3 以5,000 × g 离心15 min收集包涵体和细胞碎片。
4 去上清后重悬于20 ml 1X Binding Buffer。
5 超声破碎至悬液应该变清亮。
（在第五步之前可加溶菌酶处理或反复冻融几次以促使菌体破碎。）
6. 以5,000 × g 离心15 min后将沉淀重悬于5 ml 1X Binding Buffer（包含6 M 尿素）并加蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1mmol/L 。
7 放置冰上1 h 以完全溶解蛋白后以16,000 × g离心30 min去除不溶物质。并将上清在用Ni2+亲和柱纯化之前用0.45-μm 的滤膜过滤。

纯化带组氨酸的重组蛋白
1 将过滤后的样品上柱，使流速降低以使样品与Ni2+树脂充分结合。
2 再用十倍体积的1X Binding Buffer（包含6 M 尿素）过柱。
3 用1X Wash Buffer（包含6 M 尿素）洗柱。至流过液A280<0.01且基本保持水平。(大约1~2h）
4 用1X Elute Buffer（包含6 M 尿素）结合的蛋白,并开始收集样品(1ml/管)，直至A280又恢复至基准线。收集的蛋白SDS-PAGE检测蛋白纯度。

纯化蛋白的透析和冻干
1 透析袋预处理：用10mmol/L NaHCO3，1mmolEDTA煮沸透析袋30min；再用ddH2O煮10min。
2 将蛋白溶液移入透析袋。
3 将其放入10倍体积以上的含3 M 尿素的去离子水中，用磁力搅拌器搅拌，于4℃透析。透析液中的尿素浓度以3 M—1.5 M—0.75M—0M 递减。
4 透析完成后将蛋白质溶液离心取上清，每500µl分到一个1.5mlEP管中，于真空冻干机（MAXI Dry Lyo）中冻干。冻干的蛋白溶于PBS，SDS-PAGE检测蛋白纯度和降解程度。
5 用完的透析袋用去离子水洗净并煮沸10min，于20%乙醇中保存。

Ni2+亲和柱的后处理和重生
1 纯化完毕后，Ni2+柱用去离子水过柱1～2h，再用20%乙醇过柱1～2h。
2 为保证亲和柱的活性，可进行再生
先用下列试剂依次冲洗层析柱：2倍体积的6mol/L盐酸胍，0.2mol/L乙酸；5倍体积水；2倍体积2%SDS；1倍体积25%、50%、75%乙醇；5倍体积乙醇；1倍体积75%、50%、25%乙醇；1倍体积水；5倍体积100mmol/L EDTA；1倍体积水。再用小于2倍体积的0.1mol/L NiSO4溶液再生，用水洗，最后用平衡缓冲液平衡。

8X Binding Buffer (8X = 4 M NaCl, 160 mM Tris-HCl, 40 mM imidazole, pH 7.9)
8X Wash Buffer (8X = 4 M NaCl, 160 mM imidazole, 160 mM Tris-HCl, pH 7.9)
4X Elute Buffer (4X = 4 M imidazole, 1 M NaCl, 80 mM Tris-HCl, pH 7.9)
加入尿素的溶液需现配现用。此外1X Wash Buffer中的咪唑浓度为20~60 mM，在实验中可依不同情况加以调节。

包涵体复性问题注意：
在有的复性过程中有蛋白沉淀析出，有建议表示：甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用（透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果）。低分子化合物脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。此外复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/m。
复性原则
1 低浓度（可稀释后再进行透析）
2 平缓梯度（尿素浓度和pH:最适pH值范围为8.0-9.0之间）
3 低温 (温度适宜选择4℃)

包涵体纯化（二）
----（2010-7-31更新）
当蛋白大量表达在包涵体 且不易用NI2+柱纯化下来的时候，可以用以下的方法进行包涵体的洗涤纯化。
诱导的大肠杆菌，5000g 离心5min，收集菌体；使用超声裂解法结合反复冻融法的方法进行细菌裂解。

超声裂解法
超声破碎 缺点是发热，剪切力强烈。纯化活性蛋白的时候最好少用。
(1). 要设定好超声时间和间隙时间，一般每次超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护蛋白的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数60次 （5min）。具体的超声条件，可以自行摸索！
(2) . 一般超声用的溶液为binding buffer 10mL/g菌体湿重，超声时的溶液最好放在玻璃烧杯中 有利于散热！增大溶液体积，也有利于充分超声裂解。
(3) . 如果是表达蛋白可溶，而且菌液浓度合适时，超声后菌液应该变澄清。表达包涵体的菌液超声到液体发淡淡的白灰色即可。也可以用显微镜检测完整菌量，再决定是否再继续超声。
反复冻融法
1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2、至少3次以上冻溶。
3、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻

细菌裂解完后（最好细菌破碎比较彻底），5000g 离心15min使包涵体沉淀，去上清后进行洗涤，以除去包涵体沉淀中的杂质蛋白，洗涤时用搅拌器在4℃进行，洗涤buffer是以下三种：每步洗涤后5000g 离心15min沉淀包涵体。

Inc-A：10mL/L Triton-100； 1mM EDTA； 10g/L DOC; 50mM Tris-Cl pH 8.5;100mM NaCl
Inc-B: 50mM Tris-Cl pH 8.5;100mM NaCl; 2MUrea; 5mM 巯基乙醇；1mM EDTA
Inc-C: 50mM Tris-Cl pH 8.5
其中A，C可多次洗涤，次数和时间影响不是很大（我一般2-3次共30min，但是B的洗涤时间一般可根据纯化效果决定，时间越长蛋白被尿素溶解，得到的蛋白量越少，但纯度有一定上升，个人一般洗涤1h）

最后得到的包涵体用6-8M尿素溶解后跑胶观察纯度。后可使用梯度透析将尿素去除（参考蛋白纯化POTOCOL），使用蔗糖 或 PEG透析浓缩（将蛋白样品装进合适的透析袋中，埋在蔗糖或者PEG中），也可以直接免疫兔子。

所有操作于4℃进行。并在每次离心后适量加入蛋白酶抑制剂。