PCR技术及其延伸与应用(课堂PPT).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR,技术在医学领域的应用,1,聚合酶链反应或多聚酶链反,(Polymerase Chain Reaction,PCR,）又称无细胞克隆技术,(“free bacteria”cloning technique),特定的,DNA,片段在体外进行快速扩增的新方法。,在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个,DNA,分子扩增,10,7,10,8,倍，大大提高了,DNA,的得率。,2,PCR,技术最早由美国,Cetus,公司人类遗传研究室,Kary Mullis,及同事于,1985,年发现并研制成功的；,最早的应用报道是,Saiki,等,1985,年将,PCR,技术应用于,-,珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。,使用,1976,年,Chien,等分离的热稳定性,Taq DNA,聚合酶，使,PCR,操作大为简化，并使,PCR,自动化成为可能；,1987,年,Kary Mullis,等完成了自动化操作装置，使,PCR,技术进行实用阶段。,3,PCR,已获得广泛应用,目前，每年都有上千篇文章发表。,1991,年，期刊“,PCR,方法与应用”（,PCR Methods and Application,）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。,Kary Mullis,因发明了“聚合酶链式反应”而获得,1993,年度诺贝尔化学奖。,(,一名加拿大籍英国科学家,Michael Smith,因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与,Mullis,同享此荣,),4,PCR技术检测细菌,鸭疫里默氏杆菌,霍乱弧菌,食源性病原细菌,结核杆菌,5,PCR与病毒类疾病应用,杂交法检测植物病毒和类病毒,利用RT-PCR对黄瓜病毒源种类进行检测,诊断人类乳头状病毒HPV感染,6,诊断遗传疾病,7,PCR的特点,特异性高,-,聚合酶,首次报导用大肠杆菌的,DNAPolymerase I,的,Klenow,大片段。,90,会变性失活，需每次,PCR,循环都要重新加入；同时引物是在,37,延伸,Taq DNA,聚合酶,1988,年,Saiki,等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的，扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一,8,高度敏感：,理论上,PCR,可以按,2,n,倍数扩增,DNA,十亿倍以上。,应用证实可以将极微量的靶,DNA,成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的,DNA,。,能从,100,万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含,0.01pg,的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。,9,快速,简便,可扩增RNA或cDNA,10,试剂,引物：,决定扩增的特异性。根据检测的,DNA,不同，选用不同引物。,耐热的,DNA,聚合酶：,10PCR,缓冲液,500mmol/lKCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml,明胶。,dNTP,贮备液,DNA,模板,11,操作程序,试剂混合,PCR,仪程序设计,：,94,变性,30s,，,55,退火,20s,，然后在,72,延伸,30s,，共循环,30-35,次。最后一次循环结束后，再将反应管置,72,温育,5min,，以确保充分延伸。,12,PCR,反应基本条件及其对,PCR,的影响,模板核酸,有机溶剂酚,蛋白质污染,核酸污染,核酸的量,13,引 物,引物与PCR的特异性，,引物限定扩增产物的大小。,合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。,冻干引物于-20至少保存12-24个月，液体状态于-20可保存6个月。引物不用时应存于-20保存。,14,缓冲液,缓冲液的目的：给,Taq DNA,聚合酶提供一个最适酶催反应条件。,目前最为常用的缓冲体系为,10-50mmol/L,Tris-HCl(Tris,是一种双极性离子缓冲液，,pH,变化于,6.8-7.8,之间。将,Tris,浓度加大到,50mmol/L,，,pH8.9,有时会增加产量。,50mmol/L,以内的,KCl,，,50 mmol/L,以上的,KCl,则抑制,Taq DNA,聚合酶的活性。有些反应液中以,NH+4,代,K+,。,反应中加入小牛血清白蛋白（,100g/ml,）或明胶（,0.01%,）或,Tween 20,（,0.05%,0.1%,）,5mmol/l,的二硫苏糖醇（,DTT,）有助于酶的稳定，尤其在扩增长片段（此时延伸时间长）时。,15,Mg2+,Mg,2+,浓度直接影响着酶的活性与忠实性。影响着引物的退火，模板与,PCR,产物的解链温度引物二聚体的形成等。,Mg,2+,浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。,Taq DNA,聚合酶需要的是游离,Mg,2+,。,DNA,模板，引物和,dNTP,的磷酸基团均可与,Mg,2+,结合，降低,Mg,2+,实际浓度。,16,三磷酸脱氧核苷酸dNTP,dNTP是DNA合成的基本原料。,含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。,dNTP浓度过高会导致其错误掺入（即所谓的“热力背信”）。一般认为最适的dNTP浓度为50200mol/L。,dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。,17,耐热DNA聚合酶,Taq DNA,聚合酶取代了大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,大片段使,PCR,得到广泛应用。,Taq DNA,聚合酶是从水生栖热菌,Thermus Aquaticus,（,Taq,）中分离出的热稳定性,DNA,聚合酶。,Taq DNA,聚合酶简化了,PCR,程序,增加了,PCR,特异性及,PCR,扩增效率该酶的最适温度很高（,79,），,100l,反应液中含,1-2.5u Taq DNA,聚合酶为佳，,Taq DNA,聚合酶保存不当而失活是,PCR,实验失败的常见原因。,18,温度循环参数,变性温度与时间,复性温度与时间,延伸温度与时间,循环数：,19,PCR实验中常见问题对策,假阴性问题,假阳性问题。,20,假阴性,Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制,引物设计不合理,提取的模板质量或数量不过关以及,PCR系统欠妥当,循环次数不够,21,假阳性,微量的靶基因污染,标本间的交叉污染,样品中存在有靶基因的同源序列,PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次性吸头。,22,PCR技术的延伸,PCR,是一种技术和方法，在使用中不同的人根据自己的试验目的、结合自己的知识背景、研究、创造了不同的,PCR,方法，开拓了,PCR,应用的新领域。现在至少有,15,种不同的,PCR,用于不同的试验。,23,反转录,PCR-Reverse transcription PCR,一种检测底丰度特异 的方法,互补靶,cDNA,生成,双链靶,DNA,扩增靶,DNA,24,RTPCR反应体系,PCR,的反应体系但是模板是,RNA,RNA,酶抑制剂,RNasin,反转录酶,禽酶禽类成髓细胞性白血病病毒,(Avian myeloblastosis virus,AMV),鼠酶莫洛尼鼠白血病病毒,(moloney murine leukemia virus),25,Touch down PCR,一般PCR的体系,一般PCR的设计原理,不同的PCR过程,目的：在不知道理想退火温度的条件下保证扩出产物,26,梯度PCR,在特殊,PCR,仪上进行的一般,PCR,目的：寻找最佳的退火温度,与,TouchDown PCR,的区别,TD PCR,：对同一,PCR,体系采用不同的退火 温度进行,PCR,循环,梯度,PCR,：同时对多个,PCR,体系采用不同的退火温度进行,PCR,循环,27,巢（套）式,PCR-nested Primer PCR,不同的PCR体系两对引物,不同的PCR过程两段循环,目的：增加特异性和灵敏性,28,复合PCRMultiplex PCR,采用多对引物扩增多条目的片断,目的：同时检测多种病原微生物,关键问题,不同引物,Tm,应相差不大,目的片断大小相差不大,29,反向PCRReverse PCR,一般PCR的引物是相向的，而这里的引物是反向的。,目的：扩增已知序列两端的序列,方法：酶切连接成环,30,谢谢,31,