质粒的提取和纯化.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,质粒的提取和纯化,1,内 容,一.质粒的概念和提取原理,二.碱裂解法的实验操作和原理,三.煮沸法快速提取质粒的实验操作和原理,四.实验室使用的方法,五.质粒纯化后的检测,2,一.质粒的概念和提取原理,质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活.,3,一.质粒的概念和提取原理,质粒在细胞内的复制一般有两种类型:,紧密控制型(Stringent control),松驰控制型(Relaxed control),4,一.质粒的概念和提取原理,在pH 12.0 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。,5,实验中使用的三个溶液,1,溶液：,葡萄糖,使,悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部.,Tris.Cl(pH8.0),提供反应的最佳环境.,EDTA(pH8.0),Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,抑制DNase(脱氧核糖核酸酶)的活性和抑制微生物生长,.,6,实验中使用的三个溶液,2,溶液：NaOH(临用前用10mol/L NaOH,母液稀释)1 SDS,注:要新从浓NaOH稀释制备NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO,2,而减弱了碱性,.,NaOH细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle微囊）结构的相变化,瞬间就溶解,.,当然SDS也是碱性的,但是很弱,只能抽提得到少量质粒.,7,实验中使用的三个溶液,3,溶液：KAc 冰醋酸 ddH,2,O,注:冰醋酸的作用是为了中和过量的NaOH.,KAc是提供K,+,和SDS反应,取代Na离子,形成十二烷基硫酸钾(PDS),而PDS是难溶于水的.SDS易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,同时长长的基因组DNA也一起被共沉淀了.但是SDS并不与DNA分子结合.,8,二，碱裂解法的操作步骤,1,取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液,高速离心,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。2,加入溶液I,充分悬浮菌体细胞。3,加入新配制的溶液II,盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴5分钟。4,加用冰预冷的溶液III,摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。5,4下离心15分钟。,9,二，碱裂解法的操作步骤,6,取上清液,加入 RNA酶A,37水浴20分钟。7,加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4下高速离心10分钟。8,取上层水相,加入等体积氯仿,振荡混匀,4下高速离心10分钟。9,取上层水相,加入2倍体积的无水乙醇,室温放置几分钟,离心。10,4下高速离心15分钟,沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤,4下高速离心5分钟。11,吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。,12,得到的质粒样品一般用TE缓冲液或者ddH,2,O进行溶解.,10,注意的事项,一,在加溶液后:,.时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；.必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。,二,加入的酚必须要用氯仿和乙醇洗涤干净,否则对后面的实验有影响.,三,沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。,四,提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提.,11,三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤,（1）将 2ml 含相应抗生素的 LB 培养基加入到容量为 15ml 的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在 37 剧烈震荡（250rpm）培养过夜。（2）将 1.5ml 培养物转入离心管中，在 4 条件下离心 30 秒。（3）弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于 200 m l STET 缓冲液（8%蔗糖，0.5%Triton,50mmol/L EDTA,10mmol/L Tris），用涡旋混合器充分混匀。（4）加入 4 m l 新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下 5min。（5）用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时 45 秒，取出后立刻离心 10min。,12,三，煮沸法快速提取质粒的操作步骤,（6）用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入 8 m l 5%CTAB(十六烷基三甲基溴化氨)，用混合器混匀后，高速离心 5min，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体。（7）加入 1.2M 氯化钠 300 m l，充分溶解沉淀物，再加入 750 m l 的冷乙醇，充分混匀后，离心 15min，弃上清液。（8）取 1ml 70%冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心 5min。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥 5-10min。（9）沉淀物溶于 50 m l TE 缓冲液中，混合器混匀。（10）即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用.,13,四，实验室使用的操作步骤,1,取1.5ml含细菌的培养液,离心,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。,2,加入溶液I,充分悬浮菌体细胞。,3,加入新配制的溶液II,盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴5分钟。,4,加用冰预冷的溶液III,摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。,5,4下离心15分钟。,14,四，实验室使用的操作步骤,6,取上清液加新的离心管中.,7,加入纯化树脂,混匀,放置10min.,8,将溶液转移到离心纯化柱中,高速离心.,9,倒掉下管中的溶液,再加80%异丙醇,洗涤两次,每次离心30s,再干甩一次,20min.,10,将离心纯化柱内管取出,放入新的离心管中,加入30l的ddH,2,O 洗涤,静置10min,高速离心5min.,11.离心管中即得到溶于ddH,2,O的质粒.,15,五，质粒纯化后的检测,超螺旋,开环,复制中间体,可能会出现的RNA带,注:碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA.,16,