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抗冻基因CBF2表达载体构建及转化紫花蓿

摘要: 以拟南芥基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上构建成克隆载体T-CBF2。用BamHⅠ和SacⅠ分别对克隆载体T-CBF2和植物表达载体PBI121进行双酶切,获得目的片段和线性质粒。在T4DNA连接酶的作用下进行定向连接,构建成植物表达载体P-T-CBF2。采用直接转化法将重组子导入根癌农杆菌EHA105。

关键词: 抗冻基因CBF2;载体构建;农杆菌;紫花苜蓿;转化

正 文： CBFs(冷诱导基因)由一个小的基因家族编码,包含3个成员CBF1、CBF2和CBF3,3个基因都聚集在拟南芥的4号染色体短臂上,紧密连锁在一起,均可在冷胁迫下迅速诱导表达。CBF这一冷驯化关键调节基因的发现,对植物逆境胁迫生理和抗逆植物基因工程研究产生了一定影响。CBF在植物中是相当保守的,即使是对冻害敏感的番茄(Lycopersicon esculentum),也存在具功能的CBF基因。另外,过量表达CBF除了提高拟南芥(Arabidopsis thaliana)抗冻能力外,也增强了拟南芥对干旱和盐的抗性,因此CBF可作为农作物抗逆基因工程的重要基因。
苜蓿，为温带地区重要的牧草,是重要的饲料农作物,低温是制约其生长的限制因子之一,因此抗冻基因导入苜蓿是具有重大的生态效益和经济效益的。期待通过CBF2单基因的导入显著提高苜蓿对低温的适应能力,使优良苜蓿在高寒气候区的种植成为现实,也为今后转化其他经济作物,利用CBF2基因综合改良这些作物的抗逆性奠定基础。
1．材料与方法
　1.1供试材料：
和田苜蓿(Medicago sativacv. Hetian)；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105、PBI121载体; 质粒pGEM-T Easy Vector限制性内切酶、 T4DNA连接酶及高保真DNA聚合酶。
1.2.CBF2基因组DNA的提取
用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法[8],略加修改。取培养15 d的拟南芥无菌苗。
（1) 称取200 mg叶片,在液氮处理下,在研钵中研磨成粉末状。
（2) 2 mL离心管中加入800μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液、80μL无水乙醇,颠倒离心管,使叶片粉末与提取缓冲液充分混合均匀,置于65℃恒温水浴中30 min,每隔5 min颠倒离心管数次。
（3) 30 min后取出离心管自然冷却至室温,4℃12 000 r/min离10 min。
（4) 吸取上层清液于另一离心管,加入等体积的氯仿,颠倒混匀,在室温下12 000 r/min离心10 min。
(5) 转移上层清液至另一新的离心管中,加入2倍体积冰预冷的无水乙醇,轻轻混匀。于-20℃下放置30min,使DNA充分缠绕成团。
（6) 将上述有絮状沉淀的DNA离心,4℃12 000 r/min,离心10 min,倒掉上清液。
（7) 挑取絮状沉淀,加入70%乙醇清洗2次。风干,最后加入100μL TE(10 mmol/L, pH 8.0 Tris-HCl,1 mmol/L EDTA)缓冲液充分溶解DNA沉淀。
（8) -20℃下贮存备用。
1.3　PCR(polymerase chain reactoin,聚合酶链式反应)

根据Gene Bank的CBF2cDNA已知序列,设计合成1对引物[9,10],并根据构建植物表达载体的需要在引物5′端分别引入了BamHⅠ和SacⅠ的酶切位点。正向:5′-GC GGATCC ATGAACTCAT TTTCTGCCTTTTCTG-3′,反向:5′-GC GAGCTC TTAATAGCTC CATAAGGACA CGTCA-3′,以CBF2基因组DNA为模板。反应程序:94℃3 min→(94℃30 s→57℃30 s→72℃1 min)30(此步骤为30个循环)→72℃10 min。热启动法加酶。所用酶为Taq Plus DNA Polymerase(Taq+Pfu) PCR仪为Mini CyclerTM(基因扩增仪)。

1.4　目的片段的纯化回收
对PCR产物开展琼脂糖凝胶电泳,用DNA快速纯化回收试剂盒回收目的片段具体操作按产品说明书进行。

1.5　克隆载体的构建
所用载体为PGEM-T Easy Vector(T载体系统),该载体专为PCR产物的克隆而设计,具有氨苄青霉素抗性标记,可以进行蓝白筛选,便于进行酶切鉴定和测序。连接反应体系: 3μL纯化后的PCR产物+2μL 10×Ligation Buffer(连接缓冲液)+1μL(50 mg/L) PGEM-T Easy Vector+1μL T4DNA Ligase(连接酶)。在16℃条件下连接过夜。
1.6　感受态细菌的制备及转化
感受态细菌的制备:
（1) 在LB(培养基)平板上挑取新活化的大肠杆菌DH5α接种于5 mL LB液体培养基中,37℃280 r/min震荡培养过夜(14-16 h)。
（2) 取500μL上述菌液转移到50 mL LB三角瓶中(占1%左右),震荡培养3 h(OD620=0.3~0.4)。吸取1mL菌液于2 mL离心管中,冰浴10 min。
（3) 4℃,4 000 r/min离心10 min,去上清。
(4) 加入500μL 0.1 mol/L冰冷的氯化钙,重悬沉淀,冰浴40min。
（5) 4℃,4 000 r/min离心10 min,去上清。
（6) 加入100μL 0.1 mol/L冰冷的氯化钙,重悬沉淀。
（7) 4℃存放24 h,-20℃保存备用。
转化:
(1) 取5μL连接产物,加入100μL感受态细胞,混匀(用枪轻轻吸打几次),冰浴40min。
(2) 42℃热击90 s。(勿动)
(3) 迅速将离心管转移至冰上,冰浴5 min。(勿动)
(4) 加入400μL LB液体培养基,混匀,37℃,200 r/min震荡培养1 h。
(5) 取100μL菌液,用无菌涂布器涂布于含X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)、AMP(氨苄)的LB固体培养基上。
(6) 将平板置于室温直至液体被完全吸收后倒置培养皿,37℃培养过夜20 h)。
1.7　重组质粒的鉴定
在直径9 cm的培养皿上共生成约70个白色菌落,随机挑取2个白色菌落,分别接种于2 mL LB液体培养基中,在37℃,280 r/min条件下震荡培养过夜,转接于8 mL LB中震荡培养。按碱裂解法小量提取质粒[16]。以质粒DNA为底物用BamHⅠ和SacⅠ进行双酶切鉴定。双酶切反应体系为质粒DNA 15μL+10×Buffer 2μL+ BamHⅠ1μL+ SacⅠ1μL,37℃, 4 h 。

1.8　植物表达载体的构建
植物表达载体PBI121(工程质粒)是从结瘤农杆菌双元质粒衍生而来,系一组成性表达载体,大小14 kb,多克隆位点上游带有CaMV 35S(花椰菜病毒启动子)启动子,下游带有GUS(β-葡萄糖苷酸酶基因)报告基因;在NOS(胭脂碱合酶基因启动子)启动子下游带有NPTⅡ(KAN抗性基因)基因,可进行Kanamycin(Kan,卡那霉素)抗性筛选。CBF2植物表达载体的构建过程见图1(图中:Ori V:是在营养时期,即游离在细胞质中独立复制时的复制起点;ColE1 ori:大肠杆菌质粒复制起始点;NOS:胭脂碱合酶基因启动子;npt-Ⅱ:KAN抗性基因;NOS-ter:胭脂碱合酶基因终止子;CaMV35S:花椰菜病毒启动子)。
分别对重组质粒T-CBF2、PBI121进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切,纯化回收。
回收的线性PBI121和CBF2基因片段经电泳定量后,在T4DNA Ligase(连接酶)作用下进行定向连接,连接反应体系为CBF2DNA 5μL+PBI121 2μL+10×Buffer 5μL+T4DNA Ligase 1μL,16℃连接22 h[17,18]。连接后对感受态细菌进行转化,在转化过程的培养基中添加Kan 100 mg/L
1.9　植物表达载体的鉴定
在添加Kan 100 mg/L的筛选培养基上随机挑取转化菌落,提取重组质粒的DNA,分别进行PCR鉴定、BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定。
1.10　农杆菌的转化
根癌农杆菌感受态细胞的制备。
（1) 将农杆菌EHA105(农杆菌菌株)接种于YEB (基本培养基)固体培养基上,[YEB+50 mg/L Str(链霉素)+25 mg/L Rif(利福平)],YEP为50 mL,50 mg/L Str为100μL,10 mg/L Rif为25μL。28℃培养24~36 h。
（2) 挑取新活化的农杆菌单菌落接种于5 mL YEB液体培养基上(YEB+Str+Rif),28℃,200 r/min震荡培养24~36 h。
（3) 吸取1 mL农杆菌培养液(1∶50或1∶100)接种于50 mL(YEB+Str+Rif)中,28℃,200 r/min震荡培养6~8 h,测OD600=0.3~0.5。
（4) 吸取上述菌液转入2 mL离心管中,常温5 000 r/min,5 min去上清,收集菌体。
(5) 将菌体垂悬于2 mL 0.02 mol/L CaCl2中常温5 000 r/min,5 min去上清,收集菌体( 重复2次)用200μL20 mmol/L CaCl2溶液垂悬。
（6) 液氮速冻1 min。
（7) - 70℃冰箱保存。
液氮冻融法直接转化农杆菌
（1）新鲜制备的农杆菌感受态细胞或-70℃保存的2管农杆菌感受态细胞置于室温下融化。
（2）2管200μL的农杆菌菌液中,其中一管加入1μg(5~10μL)质粒DNA,另一管加入5~10μL无菌水作对照,轻弹混匀,冰浴30 min。
（3 )置于液氮中速冻1 min,迅速取出,37℃水浴保温3~5 min融化细胞。
（4 )溶解完全后加入800μL YEB液体培养基,28℃,200 r/min培养6 h。
（5) 4℃,5 000 r/min离心3 min,弃上清,仅留下约50μL的菌液。
（6) 将菌液均匀涂布于(YEB+50 mg/L Str +25 mg/L Rif+50 mg/L Kana)平板上,28℃,培养2~3 d。在平板上可以看到转化了质粒的农杆菌单菌落,等菌落长至一定大小,4℃保存。
1.11　转化菌的鉴定
挑取转化农杆菌的单菌落接于2 mL YEP培养液(含Str 50 mg/L,Rif 25 mg/L ,Kan 100 mg/L),28℃,200r/min震荡培养18 h,转接于10 mL YEB(抗生素同上)中培养。以碱裂解法提取质粒。PCR鉴定转化菌:以转化菌的质粒DNA 1μL为模板,反应体系25μL 。
1.12　苜蓿遗传转化
设置Kan浓度梯度(mg/L):30,40,50,60,70,80,90,100;延迟选择天数梯度(d):0,5,10,15,20。进行完全区组试验。
苜蓿种子用无菌水浸泡,酒精和升汞消毒后在含3%蔗糖的MS固体培养基上无菌培养。切下7 d龄子叶,在愈伤培养基MS1[MS+2 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L KT(激动素)]上预培养3 d, 在活化的农杆菌EHA105(P-T-AFP+EHA105)菌液中浸染10 min, 在MS1培养基上和黑暗条件下共培养3 d, 然后转入筛选培养基MS2[MS1+60 mg/L Kan+400 mg/L Carb(羧苄青霉素)]中筛选抗性愈伤组织,且每2周更换1次培养基。选取生长状态良好,结构紧凑,长有绿色芽点的愈伤组织进行PCR鉴定。

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生化技术原理课程论文

学院：生命科学学院
班级：08生技- 2班
姓名：王 亚 平
学号：2008061776