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多肽和蛋白质类药物的发展过程
药物佐剂学
随着蛋白组学计划的逐步深入，蛋白质结构与功能关系逐渐被***，近年来越来越多的多肽及蛋白质类物质在诊断、治疗或作为疫苗预防各种疾病方面发挥着重要作用。与小分子药物相比，多肽及蛋白质类大分子药物稳定性差、易于被酶降解、故生物半衰期短；而扩散差、分配系数小，又使其难以通过生物屏障及脂质膜[1]，所以，如何将这些生物技术类物质有效地送达人体相应部位，一直是制剂研究面临的重大课题。 /iekww^54
目前，生物技术类药物大多以注射用溶液或冻干粉针剂应用于临床，但常需要频繁给药，致使病人的顺应性较差，且治疗费用较高。而将大分子药物通过可生物降解微球系统给药，不仅能有效防止生物大分子在体内很快被降解，还能将药物定向送达体内有效部位，并通过可生物降解聚合物的降解达到缓释长效目的。现已有的多肽及蛋白质类药物微球制剂主要有：注射用缓释制剂，口服及鼻腔吸入剂等。随着对这类微球制剂研究的深入，制备过程中蛋白质的稳定性差、包封率低、载药量小、且易于产生聚集而使其生物活性降低并可能引起免疫反应、体外释放时具有明显突释效应等问题严重影响着这类制剂的发展。本文将就目前多肽及蛋白质类微球制剂的应用、制备方法、出现的问题及常用的各种增加稳定性、减少其突释效应的物理化学方法进行综述。 ?sBbe@OC?
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1、 多肽及蛋白质微球制剂的主要类型 BVpRkUC"
1.1 注射剂 ?YO$NYwE
采用可生物降解聚合物为骨架材料，将多肽及蛋白质药物制成微球制剂用于肌肉或皮下注射，给药后随着聚合物的降解，药物以扩散、溶蚀方式释放，可达到缓释长效的目的[2]。 tu6Q7CjW8
），肌肉注射后可缓释1或2个月。Ò这类制剂中，只有10个氨基酸的LHRH类似物微球的研究最为成功，第一个多肽微球产品——曲普瑞林于1986年问世，随后亮丙瑞林、布舍瑞林、高舍瑞林、那法瑞林等长效微球制剂相继上市。2000年美国Genentech公司推出了重组人生长激素（rhGH）PLGA微球（Nutropin p; VHg

1.2 口服制剂 a:(.{z?nM
多肽及蛋白质类药物应用于口服须克服两大障碍，一是抑制胃肠道各种酶对其降解，二是选用合适的制剂形式及载体材料使药物透过生物屏障。粒径范围处于1－1000nm的毫微粒制剂是目前研究最多的口服多肽制剂，但毫微粒的表面带电荷情况及聚合物疏水性能均影响多肽在小肠部位的吸收。 s
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近年来的研究主要在对毫微粒表面进行修饰，如在毫微粒表面连接各种生物粘附材料，如脱乙酰壳多糖、Carbopol®等。Kawashima等研究者 [3]采用乳化溶剂扩散法在降钙素的PLGA毫微粒表面覆盖一层粘附材料脱乙酰壳多糖后，与原PLGA毫微粒相比，虽然药物扩散形式没有显著改变，但能明显降低血钙水平，且能维持48小时。Lubben等报道[1]，脱乙酰壳多糖及其衍生物能有效提高亲水性大分子物质的吸收，因其能增加细胞间的紧密连接的开放而有利于药物的细胞旁转运。 P` K?k<
另外，将毫微粒的疏水性聚合物骨架上连接亲水性聚合物侧链，可大大提高多肽药物的吸收，这可能是由于亲水性聚合物能打开小肠上皮细胞间的紧密连接。 'v"{frh 
1.3 鼻腔吸入剂 =A,6KY=E
将多肽及蛋白质类药物以微球制剂的形式在鼻腔给药可提高这类药物的吸收及生物利用度，这在胰岛素、降钙素、人生长激素等微球制剂中都得到了证实。尽管微球对多肽及蛋白类药物的这种促吸收机理尚不确定，但一般认为，微球与鼻粘膜直接接触而吸水溶胀，使上皮细胞脱水导致紧密连接开放，使多肽及蛋白质易于透过[4]。 mqg[2VT
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目前，将疫苗通过鼻腔给药产生局部免疫反应又是研究的一个热点。微球包载疫苗在鼻腔内给药，通过适当的佐剂（如肠毒素衍生物）、渗透促进剂（如环糊精、胆酸盐，表面活性剂、阳离子聚合物、溶血磷脂酰胆碱等）将抗原递呈至含有抗体生成细胞的淋巴组织，如鼻相关淋巴组织，可使疫苗在鼻腔引起局部免疫反应，能有效地抵抗外来物的侵蚀。动物实验及前期临床实验已证实了其有效性。Singh等报道[5]，将含粘膜佐剂（LTK63）的流感疫苗的酯化透明质酸微球给大鼠、兔子和小猪滴鼻第0和第28天，与流感疫苗溶液及通过肌注途径获得免疫相比，通过微球在鼻腔内给药获得免疫，能显著提高血浆IgG反应，具有更高的血细胞凝集抑制滴度。 6_# >s1`R
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2、 多肽及蛋白质类药物微球的制备 P2S$Dk_<\X
2.1 常用材料 X=<-rFW
用于制备多肽或蛋白质类药物的微球材料主要有两大类：可生物降解聚合物（biodegredable polymer）和及生物粘附材料(bioadhesive material)。 S;vE %
生物粘附材料是一类能对粘膜产生粘附作用的材料，主要有Carbopol®、脱乙酰壳多糖(chitosan)、羟丙基纤维素(HPC)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)等,这类材料主要用在口服及鼻腔给药的微球制剂。 qn+b
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可生物降解聚合物是指一些能在水、酶作用下降解的高分子聚合物，包括天然和人工合成两类。前者包括明胶、葡聚糖、白蛋白、脱乙酰壳多糖、海藻酸钠、透明质酸钠等；后者主要有聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸聚氧乙烯嵌段共聚物（PELA）、聚丙稀酸酯（PEC）[6]等。其中应用最广泛、研究最多的是PLGA，它不仅具有生物相容性、无免疫应答和降解产物毒性小的优点，而且可通过调节两个单体比例(PLAGA)及聚合条件改变聚合物在体内降解速度的特点[7]，但其亲脂性强、对水溶性药物（包括多肽蛋白质及疫苗）的亲和力不高。PELA是一种新型的可生物降解聚合物，由PLA和PEG（5－50％）通过开环聚合反应制得。将亲水性的PEG链接到疏水性的PLA网状结构表面，提高了PLA对亲水性物质如多肽蛋白质等的亲和力，从而提高了这类物质的包封率、降低了药物的突释效应而获得稳定而持续的释放效果。 l0m\2Ttf
聚合物分子量大小和浓度对微球的表面形态和内部结构也有影响。分子量大、浓度高，其溶液的粘度增加，形成的微球粒径较大、表面孔隙少，药物释放相对较慢，突释效应也相对较小。但聚合物分子量大，其所形成的初乳稳定性差，聚合物乳滴易于合并。 z@nJ-*'U8
通过化学聚合方法将聚合物与某一功能团共价结合，可改变聚合物的疏水性或亲水性、以及聚合物链的流动性和弹性，从而达到提高被包封药物稳定性、改善药物释放的目的。Zambaux等报道[8]，将PLA与单甲氧基聚环氧乙烷（MPEO）以一定比例（75/25）共价结合，再与PLA混合用复乳法制备具有抗凝作用的蛋白C微球，由于MPEO提高了PLA链亲水性、降低了PLA玻璃化转变温度，从而增加了PLA链流动性和弹性，而蛋白C的包封率又与聚合物中的疏水作用有关，所以按一定比例将PLA与PMEO-PLA混合作为膜材料制备微球，则既提高了蛋白C的包封率，又减少了水和蛋白C的扩散，从而减少了药物突释效应。 EPQ~V
2.2制备工艺 ubn`w=w$
制备多肽及蛋白质类药物微球的常用方法包括复乳溶媒蒸发/萃取法、喷雾冷冻干燥法、相分离法、喷雾干燥法等。整个制备工艺中，蛋白质的稳定性、包封率、突释效应是重点考察因素。以下着重介绍最常用的两种方法。 B*+3A!{s
2.2.1复乳溶媒蒸发/萃取法(double-emulsion solvent evaporation / extraction method) p:9)}y
该法是目前制备多肽或蛋白质类药物微球的最普遍方法，其一般步骤为[9，10]：将药物溶解在水或缓冲液（如磷酸盐缓冲液）中，加入含聚合物材料的有机溶媒（如二氯甲烷或醋酸乙酯等）中，搅拌形成初乳（w1/o）；将该初乳迅速倒入另一高速搅拌的水溶液(w2)中，形成w1/o/w2型复乳，继续搅拌至有机溶媒蒸发完后，即形成固态微球，或将所得复乳加入第三种能溶解有机溶媒和水、但对聚合物材料不溶的溶媒（如异丙醇）中，复乳中的有机溶媒和水被提取后固化成球；最后干燥待用。Genentech公司的rhGH微球即是以PLGA为材料采用该方法制备而成的。 wL'tGAv
2.2.2喷雾冷冻干燥法(spray freeze drying) NzmVQ-4
将多肽或蛋白质冻干粉和赋形剂（如糖类、表面活性剂、盐等）加入含可生物降解聚合物的有机溶剂中超声混匀，通过一喷头以雾状喷至液氮中使多肽或蛋白质迅速冷冻固化，再将所得的冷冻颗粒冻干，去除有机溶剂即得。在该法中，不同喷雾条件所获得蛋白质的稳定性不同，其由所用仪器设备确定。减小微球直径能减少蛋白质微球的突释效应[11]。制备过程中使用无水溶剂，避免了油水界面对蛋白质的影响，但在喷雾过程中蛋白质接触的气液界面同样影响其稳定性，所以在制备过程中须加入各种稳定剂。 Im;8Abf
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3、 存在问题 %ec9`0^4S
3.1 多肽及蛋白质稳定性 } PD]e*z{Z
复乳溶媒蒸发/萃取法制备微球时，蛋白质易于在油水界面聚集而变性。傅立叶变换红外光谱（FTIR）显示，蛋白质均匀分散在微球空穴内，其中大部分分布在微球内部孔穴壁上，这可能是在形成w/o型初乳时蛋白质聚集在油水界面层所造成的[12]。所以，形成稳定的w/o型初乳、减少多肽或蛋白质在油水界面间的聚集是将这类药物成功包封在微球中的关键。抑制蛋白质聚集、提高蛋白质在制备过程中稳定性的方法有：在内水相加入各种稳定剂（如表面活性剂、多元醇、PEG等）、改进制备工艺、改善内水相pH和在外水相加入附加剂等。 b_&;i4[
3.1.1加入稳定剂 h &3*O[`
在内水相加入一定的非离子型表面活性剂（如PVA、Pluronic® F68、Poloxamer 188和311、土温20、司盘80等）能提高初乳的稳定性，防止乳滴合并，同时能抑制多肽或蛋白质在油水界面聚集，并减少突释效应。但这种稳定作用具有浓度依赖性：即减少内水相PVA浓度，药物包封率减小，突释效应增大。这可能是由于药物与PVA的相互作用增加，从而防止了药物溶解和扩散至外水相[13]。 sp4J%2b
土温20或土温80在喷雾过程中，不仅占据雾滴的气液界面，减小气液界面张力，而且减慢液体流向雾滴的速度，进而减少蛋白质与疏水界面接触的时间，抑制了不溶性蛋白质的聚集，同时干燥和再水化时又起到了保护作用，致使蛋白质稳定性提高 [14，15]。 -jc8ku3*
多元醇或糖类如海藻糖、甘露醇、果糖、乳果糖、蔗糖等）在一定浓度下能抑制多肽或蛋白质在油水界面的聚集，有效防止其结构和功能方面的变化和进一步失活[16]。将这类物质分散在蛋白质表面，通过其与水相互作用，增加水的表面张力，提高体系自由能，蛋白质变性则会进一步增加这种热力学的不稳定性，因而蛋白质溶液在糖类存在下能保持稳定[17]。 3:Aw.-,i\
海藻糖即使在很低的浓度下也能显著提高蛋白质的稳定性，甘露醇能减少蛋白质单体的损失，但要求其最好以非结晶形式存在，并与相同的蛋白质固态相结合，防止其与蛋白质相分离而不能提高蛋白质的稳定性[14]。 gU7@}P
吸附动力学研究表明[18]，在制备微球时，一旦初乳形成，PLGA和PEG就能马上吸附在油水界面。在内水相中加入PEG400，能在形成初乳时置换油水界面的多肽或蛋白质，减少与有机相的接触，从而提高其在制备过程中的稳定性，且不影响微球形态结构。然而在微球固化时，PEG又会影响多肽或蛋白质与PLGA聚合物层的结合，相对增加了其在微球表面的含量，同时由于PEG的亲水性特征，加大了多肽或蛋白质微球在释放初期的释放量。 ;P9P2&c8c
3.1.2改进制备工艺 &uwj&-u?
多肽或蛋白质通过高速搅拌包合在海藻酸钙盐中而形成含药微芯，再以可生物降解聚合物用复乳溶媒萃取法制备微球。Zhou等利用该法制得的人血清白蛋白PELA微球的包封率高、表面光滑、稳定性高，第一天突释效应小于用传复乳溶媒萃取方法制备所得的微球[19]。 adG=L9 "n
将多肽或蛋白质类药物包封在水凝胶中形成微粒，再通过一定方法制备微球。蛋白质被包封在水凝胶微粒中，既保护其在制备时免遭有机溶媒破坏，防止其向油水界面扩散，同时由于水凝胶微粒具有快速良好的溶胀性，能吸收大量含药水溶液，在释放时也避免了与疏水和周围酸性微环境接触，提高了蛋白质在制备和释放时的稳定性[20]。Woo等将牛血清白蛋白包封在羟乙基淀粉的丙烯酸酯（acHES）水凝胶中制成微粒，再与PLGA通过溶媒萃取/蒸发法制得的微球不仅态圆整、表面光滑、包封率高，而且提高了蛋白质活性，降低了突释效应[21]。 j9zK=eG
在w1/o/w2复乳法中，由于水相的存在，加速了蛋白质扩散至外水相而降低了包封率，同时由于蛋白质的两亲性，其在油水界面易于聚集，结构易于伸展而发生变性。因此，考虑用油相代替水相，将蛋白质冻干粉直接混悬于聚合物有机溶液（如乙腈、二氯甲烷）内，然后滴入另一高速搅拌的有机溶媒（如棉籽油）中，并用石油醚提取乙腈而制得到微球；在蛋白质混悬液中加入凝聚剂（如二甲基硅氧烷），再用正庚烷固化成球[22,23]。Jiang等用这种o/o成球技术制得的微球，由于蛋白质以固体形式分散在有机溶媒中，减少了蛋白质间的聚集和化学反应，蛋白质包封率、稳定性均得到显著提高。Carrasquillo等用该法可显著提高蛋白质二级结构的稳定性，但所获得的微球的突释效应明显（大于60％）。 SST1vzm!
3.1.3 应用超临界技术 +u1meh3u
超临界流体（supercritical fluids SF）是指温度和压力超过临界温度（Tc）和临界压力（Pc）的气体和液体。在超临界状态下，物质既象气体一样容易扩散，又具有液体的良好溶解能力。特别是在临界点附近，温度和压力的微小变化可以显著影响超临界流体的密度和溶解能力。二十世纪八十年代以来，超临界流体技术在国际上得到了迅速发展和广泛应用，涉及领域包括药物提纯、化学反应、高分子合成、药物新剂型制备等采用超临界流体技术制备微粒制剂，能尽可能少用有机溶媒，并在制备过程中能控制微粒性质[24]。Winters等采用超临界流体技术制备得到的胰岛素、胰蛋白酶、溶菌酶微球粒径均匀，在不同温度下能稳定一年以上，且蛋白质失活降低[25]。 DPuz'e*
3.1.4 改变外水相pH及加入附加剂[9] R u^v!l`!7
当外水相pH接近所要包封蛋白质等电点时，微球载药量及药物包封率最高，这可能是当外水相处于蛋白质等电点时，其溶解度最小，从而使初乳中蛋白质难以渗出的缘故。 -!uut7Z|
在外水相中加入一定量的电解质（如NaCl）、糖类（如D-山梨糖醇）有利于蛋白质包封，这可能是在第二次乳化时增加了蛋白质从W/O初乳中扩散至外水相的分配系数和渗透压，而阻碍了蛋白质由初乳向外的扩散。 I^iJ^Z]vx
3.1.5加入低溶解度无机碱盐[26,27] %Z@+K_X9x
蛋白质在PLGA微球中不稳定的主要原因是，制备时聚合物中少量残留的水、以及PLGA等聚合物降解时所形成较强的酸性环境。为了使聚合物降解时保持近中性，考虑在制备时加入少量溶解度小的无机碱盐，以中和聚合物降解时所形成的酸性环境，从而提高蛋白质在微球中的稳定性。该类无机碱盐包括Mg(OH)2、Zn(OH)2、Ca3(PO4)2等。 cE}R7,y
3.1.6 修饰蛋白质 t^0^He$Ot
将蛋白质与醋酸锌结合形成比蛋白质单体更稳定的锌－蛋白质二聚体复合物，抵抗在气液界面的疏水作用，抑制蛋白质聚集，在降低了比表面积同时，又不会对微球的大小和蛋白质结构产生影响，从而提高了蛋白质在制备过程中的稳定性[18]。 w9 I7pIIl
3.2 突释效应及其解决方法 ^6!C":f
微球冻干后往往会导致微球表面形成许多小孔穴，这些孔穴使蛋白质类水溶性物质易于从中释放，从而表现为药物的突释效应。此外在微球制备中，原聚集在油水界面上的蛋白质易快速溶出也是引起此类微球中蛋白质突释的原因之一[10]。 [%(}e1T(
将多肽或蛋白质与PEG结合形成PEG化的多肽或蛋白质，抑制其在油水界面的聚集，减少水不溶性聚合物的形成，增加其在溶液中结构和功能的稳定性；同时，PEG化后能延长蛋白质在体内循环时间，延长其生物半衰期。由于蛋白质表面的PEG化使蛋白质占有的空间体积增大，从而难以从小孔扩散，也起到了降低其突释效应的作用[28，29]。Diwan等报道，将溶菌酶接上对甲氧基聚乙二醇（mPEG5000）后，其生物活性不变（101.3±10.4％），但对有机溶剂（如二氯甲烷）和制备过程中搅拌的稳定性大大增强，对空白PLGA微球的吸附作用降低，相对于不接mPEG的溶菌酶，其突释效应大大减少（1小时释放从近50％减少至约10％），而总释放量反而增加（83天，释放量从70％上升至90％以上）。 >AsD6]
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多肽及蛋白质类药物微球给药系统具有缓释长效作用，因而成为生物技术类药物制剂研究的热点。但是，由于多肽及蛋白质自身结构复杂、各种不同聚合物材料和制备方法对多肽及蛋白质类药物的稳定性均有不同程度的影响，而各种稳定蛋白质的方法尚处于考察研究阶段。因此在制备多肽及蛋白质类药物微球时，应根据具体情况选择合适的材料和制备方法，以获得最理想的实验结果。