非程序性DNA合成试验.doc

1  范围
本方法规定了非程序性DNA合成试验的基本技术要求。
本方法适用于评价保健食品的诱变性和/或致癌性。用这种短期筛选方法可以检测出一些短期体外试验法所不能检出的诱变剂和/或致癌剂。

2 术语和定义
下列术语和定义适用于本方法。
非程序性DNA合成（Unscheduled DNA Synthesis，UDS）：当DNA受损伤时，损伤修复的DNA合成主要在S期以外的其它细胞周期，称非程序性DNA合成。

3 原理
正常情况下，于细胞有丝分裂周期中，仅S期是DNA合成期。当DNA受损伤时，损伤修复的DNA合成主要在其它细胞周期，称程序外DNA合成，即UDS，因此发现UDS增高，即表明DNA发生过损伤。
在体外培养细胞中，用UDS的测量来显示DNA修复合成的主要关键在于如何鉴别很高水平的半保留DNA复制和水平较低（充其量只有半保留DNA复制的5％）的UDS 。这可以用同步培养将细胞阻断于G1期并用药物（常用羟基脲）抑制残留的半保留DNA复制后显示。同步培养可用缺乏必需氨基酸精氨酸的培养基（ADM）使DNA合成的始动受阻而使细胞同步于G1期。
在这些半保留DNA合成明显抑制和阻断了的细胞中，UDS即可用3H-胸腺嘧啶核苷的掺入增加显示。它可用放射自显影或液体闪烁计数法进行测量。

4 试剂与器材
4.1 试剂
全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为双蒸水。
4.1.1 参考阳性物对照物：可用7,12-二甲基苯并蒽（7,12-dimethylbenzathracene），2-乙酰氨基芴（2-acetylaminofluorene），4-硝基喹啉氧化物（4-nitroquinoline oxide），N-甲基亚硝胺（N-dimethylnitrosamine）。
细胞增殖用培养基：Eagle氏最低要求培养基（Minimal Essential Medium，简称EMEM）85份，小牛血清15份，加入青霉素、链霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及100 mg/mL。EMEM 培养基可选用各种商品供应之粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除菌。4℃ 冰箱贮存。
4.1.2 同步用培养基：不含精氨酸之Eagle 氏MEM 培养基（ADM）98份，小牛血清2 份，青霉素、链霉素浓度同细胞增殖用培养基。
4.1.3 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）
贮液A：将氯化钠160 g，氯化钾8 g，硫酸镁（MgSO4•7H2O）2 g 及氯化镁（MgCl2•6H2O）2 g溶于800 mL双蒸水（50～60℃）中 。另取无水氯化钙2.8 g溶于100 mL 双蒸水中。将上述两溶液混合后，加水至1000 mL ，加入三氯甲烷2 mL ，保存于4℃冰箱中。
贮液B：将磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）3.04 g（或 Na2HPO4•2H2O 1.2 g）、磷酸二氢钾（KH2PO4•2H2O）1.2 g （或KH2PO4 0.95 g ）、葡萄糖20 g溶解于800 mL双蒸水中，加入100 mL 0.4％ 酚红溶液（取酚红1 g ，溶于 3mL 1mol/L氢氧化钠中，待完全溶解后，加入双蒸水中至250 mL），加水至1 000 mL，加入三氯甲烷2 mL，保存于4℃ 冰箱中。
    贮液C：1.4％ 碳酸氢钠以双蒸水配制。
    应用液的配制：取A液1份，B液1份，水18份，混合后分装于玻璃容器内；高压灭菌，4保存。用前加入1.4％碳酸氢钠，将pH调整至7.2～7.4 。
41.4  磷酸缓冲液（无钙、镁的 Dulbecco 氏磷酸缓冲液）（pH 7.4）
取氯化钠8.00g 、磷酸二氢钾 0.20g、氯化钾 0.20g 、磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）2.89 g 溶于1000 mL 双蒸水中。
4.1.5  0.02％ 乙二胺四乙酰二钠或四钠（EDTA）溶液。
取EDTA 0.2 g 溶于无钙、镁之磷酸缓冲液中，使成1000 mL。高压灭菌后使用。
4.1.6  抗菌素贮存液
取临床注射用青霉素G 100万单位及链霉素1 g之粉针，在无菌操作下溶于100 mL之灭菌蒸馏水中，使青霉素及链霉素在溶液中之浓度分别为1万单位及10 000 mg/mL，使用时每100 mL培养基中加入抗菌素贮存液1 mL 。
4.1.7  大鼠肝微粒体S-9组分的制备：按GB15193 .4 执行。
S—9 混合液可按以下方式配制：将磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 86.8 mg、磷酸二氢钾7.0 mg、氯化镁（MgCl2•6H2O）8.1 mg、6-磷酸葡萄糖（G-6-P）5.4 mg、辅酶Ⅱ(COⅡ)（纯度90％）4 mg 溶于ADM中，加入l mol/L N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）溶液0.2 mL及大鼠肝S-9 组分0.8～4 mL 或20 mL，并用碳酸氢钠溶液调整pH至7.2～7.4 。 4.1.8  显影液及定影液（放射自显影用）
4.1.8.1  Kodak D-170显影液
贮液：无水亚硫酸钠25g 、溴化钾1g，水加至200 mL。使用时用水稀释至1 000 mL，溶入Amitol （2-氨基酚盐酸盐）4.5 g 。
4.1.8.2  Kodak D-196显影液
水（50℃）500 mL，顺次溶入米吐尔（硫酸对甲氨基苯酚）2 g，无水亚硫酸钠72g，对苯二酚8.8 g，无水碳酸钠48g，溴化钾4 g，加水至全量1 000 mL。
4.1.8.3  停显液：98％ 冰乙酸15 mL，加水至1 000 mL。
4.1.8.4  Kodak F-5定影液
水（50℃）100 mL，依次溶入海波240 g，无水亚硫酸钠15 g，28％乙酸48 mL，硼酸7.5 g，钾矾15 g，加水至1 000 mL。
4.1.9  0.25 mol/L及0.5 mol/L高氯酸：70％高氯酸：（售品）8.57 mL，加水至100mL为1 mol/L。
4.1.10  闪烁液：称取2,5-二苯基 恶唑（PPO）5 g、l,4-双-［5-苯基 恶唑基-2］-苯（POPOP）300 mg溶于甲苯中，使成1 000 mL。
4.2 器材
应用一次性细胞培养用器皿及微孔滤膜，可避免繁琐的洗涤工作，并可提高实验质量。
4.2.1 玻璃类：在自来水中将污物冲净，在肥皂或洗衣粉溶液中煮沸5min，稍冷后在热肥皂水内反复洗刷，用自来水冲洗干净。干后浸于清洁液内过夜。取出后用自来水反复冲洗12次。再用蒸馏水冲洗2次，于蒸馏水浸泡24h。取出后用蒸馏水再冲洗2次，烘干。所用玻瓶用纸包扎瓶口，移液管及滴管在近端管内塞入棉花栓后用纸包裹。
4.2.2 橡皮类：自来水中冲洗干净后，在肥皂水内煮沸，若为新购置的，则用4％氢氧化钠煮沸10min ，再用4％盐酸煮沸10 min。自来水流水冲洗2 h以上。再于蒸馏水中煮沸
2次，用蒸馏水冲洗后，浸泡于蒸馏水中24h，干燥后，用玻璃纸包装、置于容器内。
4.2.3  6号玻璃滤器（除菌用）：新购置的滤器浸入含少量亚硝酸钠的热硫酸内24 h，
蒸馏水抽滤后，用氢氧化钠溶液抽滤至中性，再用双蒸水抽滤2次，烘干后配上橡皮塞后
包扎。滤器使用后立即用蒸馏水抽滤一次，随后用1％ 亚硝酸钠硫酸溶液（硫酸溶液浓度0.5mol/L）抽滤后，浸于该硫酸溶液内（注意必须使滤板的两侧都浸于酸内）。清水冲洗后，用蒸馏水抽滤3次，干燥后，配塞包扎。
4.2.4 器材的消毒：对不带橡皮塞的玻具及金属用具可用干热灭菌，温度升至140℃后，保持2 h 。橡皮类及带橡皮塞之玻具应用高压灭菌120℃30min。溶液除不耐热的应用抽滤除菌外，耐热的可用高压灭菌，一般用115℃10min。
5 操作步骤
5.1 细胞的传代、维持和贮存
用于化学致癌物在体外培养细胞中诱发UDS的实验研究的哺乳类细胞的种类很多。人类细胞的UDS反应大于啮齿类细胞。在化学致癌性检测试验中很多人使用人类细胞。这有一个可取的优点，即某一化学物质对人类危害作评价时，可减轻因种属差异而导致推论错误的风险。使用最多的人类细胞为成纤维细胞，外周血淋巴细胞，单核细胞和Hela细胞等。使用人羊膜细胞 FL株，是一种上皮细胞系，且该羊膜细胞富含有可诱导的药物代谢酶系。
生长成单层的细胞，除去培养基。用Hanks平衡盐液（HBSS）洗涤后，用0.02％ EDTA或0.1％ 胰酶溶液（于无 Ca2+、Mg2+ 之磷酸盐缓冲液中）于37℃下处理数min使细胞退缩，细胞间隙增加。再用HBSS洗涤1次，加入适量培养基，反复吹吸，使细胞自玻面上脱下并分散于培养基中。取细胞悬液一滴，加于血球计数池中，计数四大格中的细胞数，计算出悬液中之细胞浓度（四大格的细胞数/4×104 即为每mL所含细胞数）。将细胞悬液生长培养基稀释至 0.5～1×105 个/mL。将上述细胞悬液接种于培养瓶中（30 mL培养瓶可接种3 mL。100 mL的可接种10 mL）。每次接种3份，长成融合单层后取其中一瓶再按以上方法传代接种3瓶。另两瓶在证明传代成功后弃去或供实验所用，这样可保证细胞在实验中延续保持。有条件可按下法将细胞贮存于液氮中。若较长时间不用，不必在实验室中维持。在需要时取出经增殖后供实验所用。将细胞增殖至所需数量后，按上法制成细胞悬液（于生长用培养基中）。细胞浓度为1～1.5×106个/ mL。在冰浴中，逐渐加入为细胞悬液总量10％ 的灭菌二甲基亚砜。然后将细胞悬液分装于洁净干燥之灭菌安瓶或细胞冻存专用塑料小管中，每份1 mL。封口后，置于4℃ 中2～3 h ，然后移至普通冰箱之冰室内4～5 h，再移入－30～－20℃之低温冰箱内过夜。次日晨将安瓶移入生物用液氮储存器内。需用时，将安瓶或小塑料管锯（打）开，除去含有二甲基亚砜的培养基，加入适量之生长用培养基，并调整细胞浓度至10～15×104个/mL。分种于细胞培养瓶中，37℃ 培养1h 后，换培养基一次，将无活力之细胞除去，待长成融合单层后分传增殖维持于实验室中。 5.2 UDS的放射自显影显示法
将细胞增殖至所需数量后，按上述方法制成单细胞悬液，细胞悬于生长用培养基（EMEM 85 小牛血清15）中。浓度为0.5～1×105个/mL。将上述细胞悬液接种于置有小盖片（18 mm×6 mm）之培养瓶中，37℃培养1～3天，使细胞在盖片上生长至适当密度。培养瓶接种数目根据检品的数目、所选剂量级别而定。每一剂量作2～3个样片，并另备4～6个样本供溶剂对照和已知致癌物的阳性对照用。细胞在增殖培养后，按以同步培养用培养基（ADM补以1％ 小牛血清）作同步培养3～4天。在实验前一日下午，加入溶于ADM之羟基脲（HU）溶液，使HU在培养基中之终浓度为10mmol/L。继续在37℃下孵育16 h，然后将上述长有细胞之盖片置于含有不同浓度之检品、HU（浓度为10mmol/L）及3H-胸腺嘧啶核苷（5～10 mCi/mL，30 Ci/mmoL）之同步用培养基中。37℃中孵育5 h。以溶剂及已知致癌物为对照。
检品及已知致癌物溶液在实验时新鲜配制。先将它们溶于适当之溶剂（蒸馏水、二甲亚砜、丙酮等）中，配成最高测试浓度100倍的储液。再依次以溶剂按10倍稀释，作成不同浓度之检品溶液。将各种浓度的检品溶液，加于培养基中，使溶剂的最终浓度为1％ 。应同时设有阳性对照组和阴性对照组，包括加S-9和不加S9两种情况。
孵育结束后，用HBSS 充分洗涤，用1％ 柠檬酸钠溶液处理10min，随后用乙醇-冰乙酸（3∶1）固定（4℃）过夜，空气中干燥后，用少量中性树胶，将盖片粘固于载玻片上，长有细胞的一面朝上，45℃ 烘烤24 h 。
在暗室中，将适量之核-4乳胶移入浸渍用之玻璃器皿中，置于40℃之水浴中令其融化，同时取等量之蒸馏水于一量筒中也置于该水浴中加热，待乳胶融化后，将热蒸馏水倾于乳胶液中，继续在水浴中加温，并用玻璃棒轻轻搅拌，等待10～20 min，使气泡逸出。在以上准备过程中，将准备作自显影处理之玻片置于水浴之平台上预热。准备就绪后，将玻片垂直浸渍于1∶1稀释之乳胶液中约5 S，徐徐提出玻片，并将玻片背面之乳胶用纱布或擦镜纸拭去。将已涂有乳胶之玻片移入温度为29℃及一定湿度之温箱中（4 h）待乳胶干涸。然后置于内置适量干燥剂（变色硅胶）袋之曝光盒中。曝光盒外包以黑色避光纸及塑料纸，置于4℃冰箱中曝光10天。曝光结束后，将玻片移入有机玻璃制成的玻片架上，在液温为19℃ 之D-170 或D-196 显影液中显影5 min，在停显液中漂洗2 min，在F-5定影液中定影6～10 min 再用水漂洗数小时。
细胞可在乳胶涂片前用地衣红（2％）冰乙酸溶液或在显影后用H.E或Giemsa染液染色。
将玻片脱水透明后，用盖片封固。
在油渍镜下，计数各样本细胞核上之显影银粒数，同时计数相当面积之本底银粒数，并自核上之银粒数减去。每张玻片至少计数50个细胞核，计出对照样本、各种浓度检品处理的样本及阳性致癌物对照样本中银粒数/核的均值及其统计量。
5.3 UDS的液体闪烁计数显示法
将实验用细胞悬于生长用培养基中，细胞浓度为0.5×105个/mL，将细胞接种于液体闪烁计数瓶中，每瓶1 mL，并加入14C-胸腺嘧啶核苷终浓度为0.01 mCi/mL（50 mCi/m moL）。37℃中培养48 h 使细胞增殖并预标记，去培养基并用HBSS 洗涤后，换以含14C胸腺嘧啶核苷（0.01 mCi/mL）之同步用培养基，在37℃中进行同步培养2～4d，同步培养结束后，于实验前一日下午去培养基，用HBSS 充分洗涤后，加入含有浓度为10mmol/L 羟基脲（HU）之同步用培养基，37℃ 中孵育16 h，UDS 的诱发同放射自显影显示法。细胞在含有HU及3H-胸腺嘧啶核苷（5 mCi/mL，30Ci/m moL）之同步用培养基中与不同浓度之检品接触5 h，孵育结束后，去培养基及检品。以冷盐水洗涤2次，随后用冰冷之0.25 mol/L过氯酸溶液处理2次，每次2 min，以固定细胞并除去酸可溶性成分，再用乙醇处理10 min 以除去脂溶性成分及未掺入之标记物，干后以0.5～1 mol/L过氯酸0.5 mL于75～80℃之恒温箱中水解40 min，使掺入之标记物释出。冷却后加入乙二醇乙醚3.5 mL 及闪烁液（PPO 0.5％、POPOP 0.03％，以甲苯为溶剂）5mL，振摇后使呈匀相，以液体闪烁计数器测定各样本中之14C及3H的放射活性。每组（包括对照组）至少作6个培养瓶。标本中的3H 放射活性即反映UDS中3H 和14C 比值作为100％（1.00），可计算出各个样本中对于对照变化量，并计算各种检品测试浓度的样本中的有关统计量。
5.4 受试物的代谢活性
建株细胞中药物代谢活化酶系的活性一般都很低，因此对一些需经酶性代谢活化才显示其DNA损伤作用的化学物质，可在试验体系中加入以大鼠肝微粒体酶系及辅助因子组成
的体外活化系统（S-9 混合液）在检品接触时所用的培养基中，另溶入或加入氯化镁
（MgCl2. 6H2O）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、6-磷酸葡萄糖（G-6-P）、NADP（Co II）及大鼠肝S-9 组分，S-9 组分所占比例视检品的亲脂性而变；亲脂性强的可用低百分数的S-9，反之，则所用S-9 组分在活化系中之比例可高些。并加入HEPES（10 m mol/mL），以碳酸钠溶液将PH 调至 7.2～7.4 。

6 数据处理
可用t检验检验各检品接触与溶剂对照间差异有无显著性而作出判断。

7 结果判定
试验组处理的细胞3H-TdR掺入数随剂量增加而增加，且有统计学意义，或者最小剂量组反应阳性，与对照组比较具有统计学意义，均可判定为该试验阳性。受试物组处理的细胞3H-TdR掺入数不随剂量增加而增加，任何一个剂量组与对照组无统计学上的差异，则认为受试物在该试验系统不引起UDS 。判定结果时，应综合考虑生物学意义和统计学意义。