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水果\蔬菜分子生物研究进展
--白菜转基因技术的研究进展
李洪(1107050428)

(中国农业大学,园艺123)

摘要: 白菜，（学名：Brassica pekinensis）二年生草本，原产于中国北方，是十字花科芸薹属叶用蔬菜，通常指大白菜；也包括小白菜以及由甘蓝的栽培变种结球甘蓝，即“圆白菜”或“洋白菜”。白菜以柔嫩的叶球、莲座叶或花茎供食用。栽培面积和消费量在中国居各类蔬菜之首。因此对于研究白菜的转基因技术是十分的重要。本文白菜类蔬菜的抗虫、抗病、抗逆、抗除草剂、雄性不育品质改良和筛选标记转基因育种研究现状，分析了转基因白菜研究中存在的问题，并指出未来一段时间对白菜类蔬菜转基因的研究重点仍会停留在建立高频再生体系和摸索其他有效方法。希望白菜的转基因技术对于我们的生活有很好的帮助。

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一、 白菜的简单介绍
白菜原产于我国北方，是十字花科芸薹属一年生、二年生草本植物。引种南方，南北各地均有栽培。十九世纪传入日本、欧美各国。白菜种类很多，北方的大白菜有山东胶州大白菜、北京青白、天津青麻叶大白菜、东北大矮白菜、山西阳城的大毛边等。 白菜是人们生活中不可缺少的一种重要蔬菜，味道鲜美可口，营养丰富，具有益胃生津，清热除烦的功能，素有“菜中之王”的美称，为广大群众所喜爱。白菜由芸薹演变而来。以柔嫩的叶球、莲座叶或花茎供食用栽培面积和消费量在中国居各类蔬菜之首。
根据进化过程、叶球形态和生态特性，把大白菜分为四个变种，其中结球变种又分为三个生态型。
散叶变种是结球白菜的原始类型，叶片披张，不形成叶球。抗逆性强，纤维较多，品质差，食用部分分为莲座叶，已渐淘汰。代表品种为山东莱芜擘白菜。
半结球变种叶球松散，球顶开放，呈半结球状态。耐寒性较强，对肥水要求不严格，莲座叶和叶球同为产品。代表品种有辽宁兴城大矬菜、山西阳城大毛边等。
花心变种球叶以抱合方式成坚实的叶球，但球顶不闭合，叶片先端向外翻卷，翻卷部分呈黄、淡黄或白色。耐热性较强，生长期短，不耐贮藏，多用于夏秋早熟栽培。代表品种有北京生产的翻心白菜、山东济南小白心等。
结球变种是大白菜进化的高级类型，球叶抱合形成坚实的叶球，球顶钝尖或圆，闭合或近于闭合。栽培普遍，要求较高的肥水条件和精细管理，产量高，品质好，耐贮藏。
不同的白菜有不同的抗病、抗旱、抗逆等特性，根据不同的基因来控制不同的基因的表达对于提高白菜的产量具有重要的作用。
二、 转基因技术的简单介绍
转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的。常用的方法包括显微注射、基因枪、电破法、脂质体等。转基因最初用于研究基因的功能，即把外源基因导入受体生物体基因组内，观察生物体表现出的性状，达到揭示基因功能和控制植物性状的目的。
其具体的过程如下：
(1)从生物有机体复杂的基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段；或者人工合成目的基因。
(2)在体外,将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。
(3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。
(4)带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖体。
(5)从大量的细胞繁殖群体中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。
(6)将选出的细胞克隆的目的基因进一步研究分析,并设法使之实现功能蛋白的表达。
其中以农杆菌介导法最为常见。具体过程如下图：

三、 白菜的抗虫基因的研究
(一) 基本介绍
白菜的害虫主要有菜青虫、小菜蛾。目前，对抗虫基因的克隆和转化的研究最多。已用于和正用于抗虫白菜类蔬菜培育的基因主要有外源凝集素基因、蛋白酶抑制剂基因和外源毒素基因。
(二) 蛋白酶抑制剂
蛋白酶抑制剂广泛存在于植物中的天然抗虫蛋白质。常用的蛋白酶抑制剂有豇豆胰蛋白酶抑制剂、马铃薯蛋白酶抑制剂和慈姑蛋白酶抑制剂等。
(1) 马铃薯蛋白酶抑制剂
马铃薯蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂类，抗虫谱是PinⅠ和 PinⅡ。PinⅠ的成熟肽只能抑制胰凝乳蛋白酶；PinⅡ成熟肽可分别抑制胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，PinⅡ基因是一类损伤诱导表达型基因，可以利用它来调控其他外源基因，达到定时表达的目的（张军杰，2002）。所以 PinⅡ比 PinⅠ更有应用价值。张军杰（2002）将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因分别转入不同的大白菜品种中进行研究得到大白菜基因PinⅡ表现出抑虫效应。
(2) 慈姑蛋白酶抑制剂
慈姑蛋白酶抑制剂是一种可抑制多种蛋白酶的抑制剂，是抗虫基因工程中常用的材料。张智奇等（1999）首次将慈姑蛋白酶抑制剂基因转入普通白菜，获得了转基因植株。研究试验表明，转基因植株对鳞翅目害虫菜青虫的生长发育有一定的抑制作用。
(3) 豇豆胰蛋白酶抑制剂
豇豆胰蛋白酶抑制剂是一类丝氨酸蛋白酶抑制剂类。它的抗虫谱广泛，对包括鳞翅目、鞘翅目以及直翅目的许多昆虫都有毒性。佘健明等（2000）将cpti基因转入普通白菜中，通过一定的检测方证实抗虫基因已被整合到转化植株的基因组，并能在自交后代植株中遗传传递。说明cpti基因具有一定的抗虫性。
(三) 外源凝集素
外源凝集素存在于植物中，它是能够与多糖类复合物上的糖基结合的蛋白质。其抗虫原理是与昆虫消化道中肠道周围细胞膜上的糖蛋白结合，从而影响营养的吸收，达到杀虫目的。杨广东等（2003）将雪花莲凝集素基因gna转入大白菜，抗蚜性试验表明，与对照相比，转基因植株表现出明显的对蚜虫生长的抑制作用，平均能抑制蚜虫密度达很大。这是研究的开始，后续一定还有跟多的研究进行着。
（四）昆虫毒素
昆虫毒素蜘蛛杀虫肽，具有专一性和毒性大的特点。从很早开始，我们的前校长陈章良先生领导的研究人员人工合成了能编码蜘蛛杀虫肽的基因，并将其成功导入烟草，获得的几株株转基因烟草对棉铃虫的杀虫率很高，并能显著抑制昆虫蜕皮和生长发育，表现出明显的抗虫作用（蒋红等，1996）。
四、 白菜的抗逆基因的研究
白菜类蔬菜生长经常面临低温、高盐和缺水等环境胁迫，因此逆境也成为影响白菜类蔬菜产量的一大因素。近年来，一些研究者开始考虑将抗胁迫基因转入白菜类蔬菜。有研究表明，植物在受到环境胁迫时，晚期胚胎发生富集（LEA）基因，会表达并增强植株的抗逆性。朱波(2008)年研究表明: 过量表达SP了基因的拟南芥获得了很明显的耐高温的抗性,通过检测野生型和转SP了基因的拟南芥的叶绿素含量、叶绿素荧光、含水量、脯氨酸及MDA含量等多种生理指标,更进一步验证了过量表达该基因提高了植物的耐高温的抗性;过量表达刀少I基因的拟南芥提高了植物的抵抗低温的抗性,通过检测野生型和转7彻I基因的拟南芥的电导率、脯氨酸、MDA含量、SOD活性等多种生理指标,更进一步验证了过量表达该基因提高了植物耐低温的抗性。
五、 白菜的抗病基因的研究
在植物抗病毒基因工程中，外壳蛋白基因策略是最早获得成功，也是至今应用最为广泛的一种策略。芜菁花叶病毒是马铃薯 Y病毒组的一个成员，是引起白菜病毒病的主要病原。朱常香等（2001）将芜菁花叶病毒的CP基因导入大白菜福山包头，获得转化植株，抗病性测定结果显示，转基因植株具有明显的抗病毒侵染能力。马伟（2002）将 CP 基因转入大白菜二牛心，经病毒接种试验表明：转基因 Tl植株发病率和病情指数明显低于对照品种，但各个单株病情指数差别较大，且随着时间的增加，抗病性有所减弱。于占东等（2006）将芜菁花叶病毒复制酶Nib反义基因转入大白菜福山包头，经检测表明：Nib 反义基因不仅整合到大白菜基因组中，而且获得表达，转基因植株的接种测试结果表明，转基因植株具有明显的抗病特性。说明控制白菜的抗病性有很多的基因和方法，有待我们进一步的研究。
六、 白菜的其他转基因
除此之外还有很到的转基因技术，比如雄性不育基因，刘乐承（2006）将花粉发育相关基因转入菜薹的菜心，获得了许多株转基因植株株系，说明：利用 RNA 干涉基因沉默可导致转基因植株的部分花粉败育。在比如抗除草剂基因，曹传增（2003）将bar基因转入菜薹 49 菜心，获得 5 株转基因植株。说明抗除草剂基因是可得的。
七、 安全问题
大多数转基因白菜类蔬菜转入的都是抗虫和抗病等有毒基因，这些转基因白菜类蔬菜中会包含有毒物质。这些物质会不会通过长时间量的积累对人体的健康造成影响，目前还无法判断。刘凡等（2005）研究认为应更着重在关于外源基因在各被渗人材料中的传递、保持及表达能力上,以及转基因性状的表达带来的对非目标生物的影响上,如:除草剂的大量使用,对农田杂草种群构成的影响,对土壤及后茬作物的影响;抗病材料可否促进病毒基因组重组及突变的发生;抗虫材料对取食生态链的影响等。

参考文献
张军杰．2002．白菜抗虫转基因研究〔硕士论文〕．雅安：四川农业大学。
张智奇，周音，钟维瑾，张建军，殷丽青，陈全庆．1999．慈姑蛋白酶抑制剂基因转化小白菜获抗虫转基因植株．上海农业学报，15（4）：4-9。
佘建明，蔡小宁，朱祯，朱卫民，张初贤，袁希汉．2000．普通不结球白菜抗虫转基因植株的获得．江苏农业学报，16（2）：79-82。
蒋红，朱玉贤，陈章良．1996．导入蜘蛛杀虫肽基因的烟草具有抗虫性．植物学报，38（2）：95-99。
朱波,2008, 不结球白菜抗逆相关转录因子的克隆及耐热耐寒相关蛋白的功能鉴定,南京农业大学, s634.3。
朱常香，宋云枝，张松，郭兴启，温孚江．2001．抗芜菁花叶病毒转基因大白菜的培育．植物病理学报，31（3）：257-264．
马伟．2002．大白菜转芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的研究〔博士论文〕．哈尔滨：东北农业大学
于占东，赵双宜，何启伟，王翠花，牟晋华，刘春香，康静．2006．TuMV-Nib 反义基因对大白菜的遗传转化研究．园艺学报，33（5）：1093-1095
刘凡，曹鸣庆，王国英，2005，以白菜为例的转基因植物环境安全性评价研究，中国蔬菜，2005（增刊）：16-22.