贝莱斯芽胞杆菌SH-1471可湿性粉剂研制及其对番茄枯萎病的防治效果.pdf

39(4)904-914 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 8 月 收稿日期：2022-11-18 基金项目：云南省科技计划重大科技专项（202202AE090010）；国家自然科学基金项目（32060624）作者简介：申云鑫，男，硕士研究生，E-mail：；*通信作者，杨佩文，研究员，E-mail：；陈齐斌，副教授，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.02.040 贝莱斯芽胞杆菌SH-1471可湿性粉剂研制及其 对番茄枯萎病的防治效果 申云鑫1,2，李铭刚3，施竹凤1，赵江源3，王 楠1,2，李者芬1,2，杨明英1，陈齐斌2*，杨佩文1*（1.云南农业大学植物保护学院，昆明 650201；2.云南省农业科学院农业环境资源研究所，昆明 650205；3.云南省微生物研究所，昆明 650091）摘要：贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis在微生物农药开发方面具有极大的潜力，对其可湿性粉剂（Wettable powder）的研发以及生产工艺优化，是推进其产业化、商业化的措施之一，且对推进农业绿色发展、实现绿色防控具有重大意义。以贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 为研究对象，采用单因素试验法筛选出对菌株 SH-1471活性影响最小的载体和助剂及其复配比例。通过室内盆栽试验测定贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 WP 对番茄枯萎病的防治效果。经筛选确定贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 WP 的配方及配比为：以高岭土为载体的母粉 87%、木质素磺酸钠 2%、NNO 8%、黄原胶 2%、抗坏血酸（VC）1%；所得制剂活菌数为 2.51010 CFU/g、细度 97%、润湿时间 12 s、悬浮率 88.6%、干燥减量 1%、pH 7.1、杂菌率为 0，各项指标均符合国家标准；连续储藏试验结果表明：180 d 4 下芽胞存活率达 87.65%，25 为 82.45%；室内盆栽试验表明可显著降低番茄枯萎病的发病率，防治效果达 93.7%。贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 WP 具有稳定性好、防效高等特点，在作物病害生物防治方面具有较好的应用前景。关 键 词：贝莱斯芽胞杆菌；可湿性粉剂；番茄枯萎病；防效研究 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)04-0904-11 Development of Wettable Powder of Bacillus velezensis SH-1471 and Its Control Effect on Tomato Fusarium Wilt SHEN Yunxin1,2,LI Minggang3,SHI Zhufeng1,ZHAO Jiangyuan3,WANG Nan1,2,LI Zhefen1,2,YANG Mingying1,CHEN Qibin2*,YANG Peiwen1*(1.College of Plant Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201;2.Institute of Agricultural Environment and Resources,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650205;3.Yunnan Institute of Microbiology,Kunming 650091)Abstract:Bacillus velezensis has great potential in the development of microbial pesticides.The research and development of its wettable powder and the optimization of its production process are one of the measures to promote its industrialization and commercialization.In addition,it is of great significance to promote the green development of agriculture and realize green prevention and control.B.velezensis SH-1471 was used as the research object.Single factor test was used to select the carrier and additive that had the least effect on its activity and its compound proportion.The control effect of B.Velesiensis SH-1471 WP on tomato Fusarium wilt was determined in a pot experiment.The formulation and ratio of B.velezensis SH-1471 WP were established as follows:kaolin as carrier parent powder 87%,sodium lignosulfonate 2%,NNO 8%,xanthan gum 2%,ascorbic acid(VC)1%;The viable count of the preparation was 2.51010 CFU/g,fineness 97%,wetting time 12 s,第 4 期 申云鑫等：贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 可湿性粉剂研制及其对番茄枯萎病的防治效果 905 suspension rate 88.6%,drying reduction 1%,pH 7.1,and impurity rate 0.All the indicators were in line with the national standards.The continuous storage experiments showed that the survival rate of spores reached 87.65%at 4 for 180 d and 82.45%at 25.Laboratory experiments showed that it had a good control effect and could significantly reduce the incidence of tomato Fusarium wilt,with a control effect of 93.7%.B.Velesiensis SH-1471 WP has the characteristics of good stability and high control efficiency,and has a good application prospect in the biological control of crop diseases.Key words:Bacillus velezensis;wettable powder;tomato Fusarium wilt;control effect 由尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 引起的番茄枯萎病，可通过侵染番茄根部并在维管束繁殖，引起维管束阻塞，导致植株萎蔫、枯死1。具有危害损失大、防治困难等特点，还可危害瓜类、茄类、豆类等多种经济作物。目前针对番茄枯萎病主要使用咯菌腈、恶霉灵、咪鲜胺等化学农药进行防治，而化学农药处理易造成环境污染、农药残留等问题，严重危害人类与环境健康2。在可持续发展和生态文明建设的背景下，随着农药工业“十三五”发展规划、“十四五”全国农业绿色发展规划等政策的推出，大力助推了生物农药产业的发展3-5。但目前新生物农药仍面临着研发难度大、生产工艺以及推广应用等方面的问题6-8。因此，加强对新生物农药产品的研发以及生产工艺优化，是推进其产业化、商业化的重要措施之一，且对推进农业绿色发展、实现绿色防控具有重大意义。截至 2022年，全国已登记的 118 个芽胞杆菌属微生物可湿性粉剂（Wettable powder）中，贝莱斯芽胞杆菌 Bacillus velezensis WP 仅占 1 个（来源于中国农药信息网：http:/ L-1 可抑制引起梨纹病的贝伦格葡萄座腔菌和粉红单端孢菌的生长，且可长期定殖于植株内部11,12；分离自水稻 Oryza sativa L 叶片的贝莱斯芽胞杆菌 E69，在高效防治叶瘟病的同时，可定殖于作物茎、叶以及维管束等部位，从而达到病害持续防控的目的13；从多花黄精根部分离的贝莱斯芽胞杆菌 ZJU-3，不仅具有产表面活性素、泛革素和伊枯草菌素等脂肽类抑菌化合物的功能，而且可产生吲哚乙酸、激动素、玉米素和赤霉素等植物促生激素14；贝莱斯芽胞杆菌 8-4 能够有效抑制马铃薯疮痂病的病原链霉菌 Streptomyces galilaeus 生长，且能提高马铃薯的产量15。总体来说，贝莱斯芽胞杆菌在生物防治、药物研发、食品发酵和工业酶制剂等领域是当前研究的热点菌株16,17，但由于其在菌种资源、生产工艺和定殖能力等方面存在问题，导致其缺乏规模化和商业化应用18。此外，国内外对于贝莱斯芽胞杆菌 WP 的研发相关报道较少，亟需加强对贝莱斯芽胞杆菌 WP 生产工艺的探索和优化并进行实际生防试验进行研究。贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 分离自健康烟草根际土壤，其对番茄枯萎病菌具有良好的拮抗作用，且具有srfA、fenB、ituA、ituD、bymA 等抗生素的合成基因，以及产蛋白酶、纤维素酶、解磷、固氮、分泌铁载体的能力19，具有广阔的应用前景。为使其可更加高效地应用于农业生产中作物病害的生物防治，并有效实现产业化发展，本文以其为研究对象，通过试验对其载体、润湿剂、分散剂、稳定剂、紫外保护剂及其复配比例进行筛选，研制贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 WP，根据可湿性粉剂质量检测标准检测其各项指标，测定其贮存稳定性，并采用室内盆栽试验模型测定 SH-1471 WP 对番茄枯萎病的防治效果，为贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 WP 的开发及进一步推广应用奠定基础。1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌种 供试菌种：贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 由云南省农业科学院农业环境资源研究所于健康烟草根际土壤分离、鉴定与保存，于 2022 年 6 月 20 日保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏编号：CCTCC NO:M 2022923，专利号：ZL 2022 1 1479280.X）。906 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 供试病原物：文中涉及的指示病原物番茄枯萎病菌由云南省农业科学院农业环境资源研究所分离、鉴定与保存。1.1.2 培养基 NA 培养基：蛋白胨 10 g/L，牛肉粉 3 g/L，氯化钠 5 g/L，琼脂 15 g/L，pH 7.07.4，蒸馏水 1 L；种子培养基（本实验室优化所得）：蔗糖 10 g/L，豆粉 10 g/L，硫酸镁 2.5 g/L，酵母膏 5 g/L，蒸馏水 1 L；发酵培养基：麸皮 10 g/L，玉米粉 30 g/L，黄豆粉 30 g/L，KH2PO4 0.3 g/L，Na2HPO4 4 g/L，蒸馏水 1 L，pH 7.07.2。1.1.3 载体和助剂 载体：膨润土、滑石粉、高岭土、硅藻土、白炭黑、凹凸棒土、高岭土、轻质碳酸钙等。润湿剂：洗衣粉、皂角粉、D425、木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠 CMC-Na（Carboxymethylcellulose）、十二烷基硫酸钠 SDS（Sodium sulfate）、十二烷基苯磺酸钠 DBS(Dodecyl benzene sulfonate)、吐温-60 等。分散剂：NNO、聚乙烯醇（PEG8000）、木质素磺酸钙。稳定剂：磷酸氢二钾（K2HPO4）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、海藻酸钠、黄原胶、轻质碳酸钙、十二烷基苯磺酸钠（DBS）。紫外保护剂：糊精、抗坏血酸 VC（Vitamin C）、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠（DBS）。文中涉及所有载体和助剂均购自上海源叶生物科技有限公司。1.2 种子液制备 将培养好的解淀粉芽胞杆菌 SH-1471 菌株用接种针划线培养接种于 NA 固体培养基上，28 倒置培养 24 h，获得单菌落。挑取单菌落接种于装有 100 mL 种子培养基的 250 mL 锥形瓶中，30、200 r/min（本实验室优化所得）振荡培养 24 h，得到种子液。1.3 发酵培养 取贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 菌株种子液，以 6%的接种量接入发酵培养基，30，200 r/min 振荡培养2 d，得到菌株发酵液。1.4 可湿性粉剂载体和助剂的筛选 1.4.1 可湿性粉剂载体筛选及母粉制备 载体吸附能力测定：分别取无菌供试载体 100 g 置于三角瓶，将SH-1471 菌株发酵液缓慢倒入三角瓶中，玻璃棒同时搅拌至载体呈流动状且不结块、不溢水，记录所倒入发酵液的体积 V，并计算载体最大吸附量：H=V/0.1（Kg/L）。润湿时间和悬浮率测定：将菌株发酵液与各载体均匀混合，经进风温度 175，出风温度 60 进行喷雾干燥后制成母粉，并参照 1.4.4 中质量检测标准中的方法，分别测定润湿时间、悬浮率。最综合考虑润湿时间、悬浮率、吸附容量以及成本等择优选择载体类型。1.4.2 可湿性粉剂助剂筛选 润湿剂和分散剂筛选：将贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 母粉分别与待选润湿剂（12%）和分散剂（12%）经超微粉碎机粉碎混合均匀后加工制成可湿性粉剂，每个处理设置 3 个重复，参照 1.4.4 中质量检测标准中的方法测定润湿时间和悬浮率，并测定胞子萌发率，结合润湿时间、悬浮率和胞子萌发率选择最佳润湿剂和分散剂。润湿剂和分散剂最佳质量配比筛选：结合润湿时间和悬浮率分别挑选出润湿剂和分散剂，以润湿剂与分散剂：1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1 的含量与贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 母粉经超微粉碎机粉碎，混合均匀后加工制成可湿性粉剂，每个处理设置 3 个重复，测定润湿时间、悬浮率和胞子萌发率，结合润湿时间和悬浮率以及胞子萌发率选择最佳配比。润湿剂和分散剂总用量对可湿性粉剂性能的影响：将筛选所得湿润剂和分散剂经超微粉碎机粉碎混匀，按上述比例均匀混合后过 325 目筛，分别以 2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的用量与贝莱斯芽胞杆菌母粉均匀混合，测定润湿时间、悬浮率和胞子萌发率。综合考虑制剂润湿性、悬浮率以及胞子萌发率，筛选出湿润剂和分散剂的最佳用量。稳定剂筛选：将贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 母粉与润湿剂、分散剂及待选稳定剂（1%、2%、3%）经超微粉碎机粉碎混合均匀后加工制成可湿性粉剂，以不加稳定剂为对照每个处理设置 3 个重复；采用农药可湿性粉剂产品标准编写规范（GB/T 19136-2003）中的试验方法进行加速贮藏稳定性测定：热贮（542），14 d 后测定芽胞含量的变化，计算芽胞损失率（%）=（储藏前芽胞含量储藏后芽胞含量）/储藏前芽胞含量100。第 4 期 申云鑫等：贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 可湿性粉剂研制及其对番茄枯萎病的防治效果 907 紫外保护剂筛选：将贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 母粉与已筛选所得的润湿剂、分散剂、稳定剂及待筛选紫外保护剂（0.5%、1.0%、1.5%）经超微粉碎机粉碎混合均匀后加工制成可湿性粉剂，以不加保护剂为对照，稀释涂布在平板上，在 254 nm 紫外灯（20W）距离 40 cm 处照射 12、24 h 后，计算芽胞存活率，筛选出最佳紫外保护剂。1.4.3 可湿性粉剂研制 将贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 发酵液与粉碎后的 1.2.3 中筛选所得载体、润湿剂、分散剂、稳定剂、紫外保护剂等按优化后的配比同时混合，边搅拌边进行喷雾干燥制成可湿性粉剂。1.4.4 可湿性粉剂质量检测 标准硬水的配制：称取无水氯化钙 0.304 g，带结晶水的氯化镁 0.139 g，放入 1000 mL 容量瓶中，用蒸馏水溶解、稀释至刻度。（1）含孢量测定：参考中华人民共和国农业行业标准（NY/T 2293.1-2012）进行含孢量测定。（2）悬浮率测定：参考农药可湿性粉剂悬浮率的测定（GB/T 14825-2006）为本试验参考标准。（3）润湿时间测定：参考可湿性粉剂润湿性的测定（GB/T 5451-2001）为本试验参考标准。（4）细度测定：参考农药可湿性粉剂悬浮率的测定（GB/T 16150-1995）为本试验参考标准。（5）含水率测定：参考农药水分测定（GB/T 1600-2001）为本试验参考标准。（6）pH 测定方法：参考农药 pH 值的测定（GB/T 1601-1993）为本试验参考标准。（7）杂菌率测定：将可湿性粉剂样品梯度稀释后，分别涂布在 NA 和 PDA 培养基上，在 PDA 平板上检测真菌杂菌数，在 NA 平板上检测细菌杂菌数，细菌与真菌总和所占总比例为杂菌率。1.4.5 制剂稳定性的测定 称取一定量的贝莱斯芽胞杆菌 WP 分别在低温（4 2）条件下以及室温（25）下连续贮存 180 d，并每 10 d 使用平板计数法检测并计算贝莱斯芽胞杆菌 WP 的芽胞存活率。1.4.6 室内盆栽防效测定 待番茄长出两片真叶后移栽，采用拌土（移栽前；含药量 30%）、灌根法（移栽后 3 d；含药量为 20%）和拌土+灌根，共 3 组处理进行贝莱斯芽胞杆菌 WP 对番茄枯萎病的防效测定；病原菌经 PDB 培养基 28 恒温震荡培养 7 d 后，无菌水稀释至 1.5107 CFU/mL 孢子悬浮液，在移栽时采用伤根法进行接种；贝莱斯芽胞杆菌 WP 的灌根方法：用玻璃棒在番茄苗根茎约 3 cm 处扎孔，深约 5 cm，将稀释液 50 mL 倒入，贝莱斯芽胞杆菌 WP 的拌土方法：以 30%的含药量进行拌土。以单接病原菌（CK1）、只接无菌水（CK2）以及 3%多抗霉素可湿性粉剂（购自青岛恒丰作物科学有限公司）为对照，每个处理20 株，设置 3 个重复，30 d 后观察并记录植株生长和发病情况。番茄枯萎病发病情况调查分组标准如下：0：无症状；1：一片或两片叶子变黄；2：三片或者四片真叶变黄叶片萎蔫下垂；3：五片或六片真叶变黄或真叶萎蔫下垂；4：全株严重萎蔫以致枯死。病情指数=（各级病株数该病级值）/（总株数最高级值）100；防效（%）=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数100。1.5 数据统计与统计 数据采用单因素方差分析、多重比较及独立样本 t 检验分析比较处理间的显著性差异。选择 Excel 和SPSS Statistics 20.0 软件进行数据统计分析，以及采用 Origin 2018 和 GraphPad Prism 8 软件制图。2 结果与分析 2.1 载体筛选 以吸附容量、润湿时间和悬浮率为指标进行载体筛选结果如表 1，7 种载体在吸附容量上具有显著差异，其中白炭黑的吸附容量最高，为 3.7 mL/g，其次为硅藻土、凹凸棒土和高岭土，吸附容量分别为 2.8、2.6 和1.9 mL/g；高岭土的润湿时间最短，为 15.7 s，其次为硅藻土和白炭黑，分别为 17.8 和 18.4 s，凹凸棒土和膨润土的润湿时间最长，分别为 61.6 和 75.5 s；高岭土和硅藻土的悬浮率最高，均超过 70%，分别为 79.5%和 66.5%，故选择高岭土作为贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 可湿性粉剂的载体。2.2 润湿剂和分散剂的筛选 将待选润湿剂和分散剂以 12%的含量与选定的载体、发酵液混合均匀，喷雾干燥制成可湿性粉剂，检测其润湿时间和悬浮率，结果如表 2 所示，以润湿时间为指标，润湿剂中木质素磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠（DBS）、洗衣粉及羧甲基纤维素钠（CMC-Na）的润湿时间最短，依次为 11.8、12.2、16.8 和 17.8 s；908 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 分散剂中 NNO、木质素磺酸钙及聚乙烯醇（PEG 8000）的润湿时间最短，分别为 13.1、15.6 和 15.8 s；以悬浮率为指标，NNO 的悬浮率最高，达 90.9%，其次为木质素磺酸钠，达 84.9%，再次为三聚磷酸钠，达84.8%，十二烷基硫酸钠（SDS）、拉开粉、木质素磺酸钙、皂角粉、洗衣粉和吐温-60 的悬浮率均超过 70%，以木质素磺酸钠和羧甲基纤维素钠作为润湿剂时，活菌数最高为 2.79109 CFU/g，以 NNO 为分散剂时，活菌数最高为 2.58109 CFU/g。综合润湿时间、悬浮率和活菌数，选择 NNO 作为分散剂、木质素磺酸钠作为润湿剂。表 1 SH-1471 WP 载体筛选结果 Table 1 Screening results of SH-1471 WP vector 载体 Filler 吸附容量 Adsorption capacity(mL/g)润湿时间 Wetting time(s)悬浮率 Suspending rate(%)膨润土 Bentonite(0.90.12)d(75.56.58)c(29.42.56)e 滑石粉 Talcum powder(0.60.11)e(30.24.32)b(51.23.65)c 高岭土 Kaolin(1.90.32)c(15.72.56)a(79.54.58)a 硅藻土 Diatomite(2.80.56)b(17.55.64)a(66.52.68)b 白炭黑 Silica(3.70.15)a(18.44.22)a(48.22.10)c 凹凸棒土 Attapulgite(2.60.44)b(61.69.12)c(30.86.58)e 轻质碳酸钙 Calcium carbonate(1.10.13)d(13.83.52)a(43.44.98)d 注：表中数据为平均值标准误；不同字母表示具有显著性差异(P0.05)。Note:Data in the table were meanstandard error.Data with different letters indicated significant difference(P0.05).表 2 SH-1471 WP 润湿剂、分散剂筛选结果 Table 2 Screening results of wetting agent and dispersant for SH-1471 WP 类型 Type 润湿时间 Wetting time(s)悬浮率 Levitation rate(%)活菌数 Number of bacteria(109 CFU/g)拉开粉 Nekal(27.42.32)c(82.96.22)a(1.590.13)b 皂角粉 Shikakai Powder(35.21.59)b(80.63.25)a(1.710.15)b 三聚磷酸钠 Sodium tripolyphosphate(44.43.25)a(84.84.65)a(1.110.11)c 木质素磺酸钠 Sodium lignin sulfonate(11.81.28)f(84.92.35)a(2.790.15)a 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)Sodium carboxymethylcellulose(17.81.98)e(69.65.62)c(2.790.21)a 十二烷基硫酸钠(SDS)Lauryl sodium sulfate(34.43.95)b(83.44.26)a(2.510.34)a 十二烷基苯磺酸钠(DBS)Sodium dodecyl benzene sulfonate(12.21.22)f(68.43.21)c(1.650.22)b 洗衣粉 Washing powder(16.80.98)e(76.22.12)b(1.000.15)c 润湿剂 Wetting agent 吐温-60 Tween-60(22.51.65)d(78.94.25)b(2.570.23)a NNO(13.11.33)a(90.94.12)a(2.580.13)a 聚乙烯醇(PEG8000)Polyvinyl alcohol(15.81.58)a(69.83.65)c(2.500.16)a 分散剂 Suspending agent 木质素磺酸钙 Calcium lignosulphonate(15.62.05)a(82.92.22)b(2.540.31)a 注：表中数据为平均值标准误；不同字母表示具有显著性差异(P0.05)。Note:Data in the table were meanstandard error.Data with different letters indicated significant difference(P0.05).2.3 润湿剂与分散剂配比筛选 由表 3 可知，润湿时间随着润湿剂木质素磺酸钠含量增多而降低，悬浮率随着分散剂 NNO 的含量降低而降低，其润湿时间最高为 12.3 s，已达标准，当木质素纤维素钠:NNO 为 1:9 时，润湿时间为 12.3 s，悬浮率最高为 88.6%，芽胞含量为 2.73109 CFU/g；当木质素磺酸钠:NNO 为 2:8 时，润湿时间为 10.1 s，悬浮率为 87.2%，芽胞含量为 2.86109 CFU/g。结合润湿时间、悬浮率及芽胞含量结果，故确定木质素磺酸钠:NNO 的比例为 2:8。2.4 润湿剂和分散剂总用量的筛选 由表 4 可知，随着润湿剂和分散剂总用量的增加，贝莱斯芽胞杆菌 WP 的润湿时间逐渐变短，当二者 第 4 期 申云鑫等：贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 可湿性粉剂研制及其对番茄枯萎病的防治效果 909 总用量仅为 2%时，制剂润湿时间为 21.6 s，显著高于其他用量，当二者总用量为 12%时，润湿时间最短为10.1 s；说明增加润湿剂和分散剂总用量对贝莱斯芽胞杆菌 WP 的润湿时间的变短具有促进作用；且随着润湿剂和分散剂总用量的增加，其悬浮率具有明显的提高，当用量为 2%时，悬浮率仅为 51.4%，当用量提高至 18%时，悬浮率达 89.9%，表明增加润湿剂和分散剂总用量对其润湿性和悬浮率均有促进作用，但随着润湿剂和分散剂总用量的提高，制剂中芽胞存活率会有一定的损失，总用量为 18%时，芽胞含量仅为 2.42109 CFU/g，相比低浓度具有一定的损失。结合润湿时间、悬浮率以及芽胞存活率，本试验中选择润湿剂和分散剂总用量为 10%，此时贝莱斯芽胞杆菌 WP 的润湿时间为 10.3 s，悬浮率为 88.6%，芽胞含量为 2.92109 CFU/g。表 3 润湿剂与分散剂最佳配比筛选结果 Table 3 Screening results of optimum ratio of wetting agent and dispersant 处理 Treatment 木质素磺酸钠:NNO Sodium lignin sulfonate:NNO 润湿时间 Wetting time(s)悬浮率 Suspending rate(%)活菌数 Number of bacteria(CFU/g)1 1:9(12.23.2)a(88.63.25)a 2.73109 2 2:8(10.13.5)a(87.24.65)a 2.86109 3 3:7(10.11.2)a(84.83.69)ab 2.85109 4 4:6(9.60.9)a(84.94.65)ab 2.86109 5 5:5(9.42.5)a(81.75.21)ab 2.92109 6 6:4(8.21.6)b(82.74.65)ab 2.84109 7 7:3(8.82.1)a(83.43.21)ab 2.76109 8 8:2(8.41.0)b(81.86.54)ab 2.78109 9 9:1(7.62.3)b(80.23.33)b 2.82109 注：表中数据为平均值标准误；不同字母表示具有显著性差异(P0.05)。Note:Data in the table were meanstandard error.Data with different letters indicated significant difference(P0.05).表 4 润湿剂和分散剂总用量筛选结果 Table 4 Screening results of total dosage of wetting agent and dispersant 处理 Treatment 木质素磺酸钠:NNO Sodium lignin sulfonate:NNO(%)润湿时间 Wetting time(s)悬浮率 Suspending rate(%)活菌数 Number of bacteria(CFU/g)1 2%(21.63.2)b(51.42.65)e 2.94109 2 4%(17.55.6)ab(68.93.58)d 2.96109 3 6%(15.31.6)a(76.42.85)c 2.95109 4 8%(12.82.6)a(83.41.96)b 2.96109 5 10%(10.31.2)a(88.63.25)a 2.92109 6 12%(10.11.1)a(88.82.22)a 2.81109 7 14%(11.81.4)a(89.61.98)a 2.78109 8 16%(11.62.5)a(89.45.32)ab 2.58109 9 18%(10.93.1)a(89.94.23)ab 2.42109 注：表中数据为平均值标准误；不同字母表示具有显著性差异(P0.05)。Note:Data in the table were meanstandard error.Data with different letters indicated significant difference(P0.05).2.5 稳定剂筛选 结合表 5 的试验结果可知，与 CK1（不加稳定剂，不热储）和 CK2（不加稳定剂，热储）相比，稳定剂的添加，可降低高温胁迫下的芽胞热储损失率，在（542）下储存 7 d 时，与 CK2（不加稳定剂，热储 7 d）相比，加了稳定剂后贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 可湿性粉剂的芽胞损失率均降低，其中以稳定剂 2%黄原胶的保护效果最好，可将热储损失率降低至 14.01%，当（542）下储存 14 d 时，在添加 2%黄原胶作为保护剂，可使热储损失率降低至 30.74%。结合生物相容性和热储实验结果，选择黄原胶 2%作为贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 可湿性粉剂的稳定剂。910 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 表 5 SH-1471 WP 稳定剂筛选结果 Table 5 Screening results of SH-1471 WP stabilizer 稳定剂 Stabilizer 含量 Content 热储前芽胞含量Initial spores content(109CFU/g)热储7 d后芽胞含量Spore content after heat storage (109 CFU/g)热储损失率 Rate of heat storage loss(%)热储14 d后芽胞含量 Spore content after heat storage (109 CFU/g)热储损失率 Rate of heat storage loss(%)1%2.21 b 1.08 b 51.13 a 0.01 b 99.55 a 2%2.55 a 1.22 a 52.20 a 0.07 a 97.41 b 磷酸氢二钾 K2HPO4 3%2.17 b 1.21 a 44.24 b 0.07 a 96.77 b 1%2.44 a 1.10 b 54.92 a 0.46 c 81.15 a 2%2.43 a 1.23 a 49.38 b 0.63 a 74.07 b 羧甲基纤维素钠 CMC-Na 3%2.22 b 1.22 a 45.05 c 0.59 b 73.42 b 1%2.48 a 0.95 c 61.69 c 0.48 b 80.65 a 2%2.46 b 1.12 a 54.47 b 0.59 a 76.02 b 海藻酸钠 Sodium alginate 3%2.51 a 1.08 b 56.97 a 0.52 ab 79.28 a 1%2.55 a 2.11 b 17.25 a 1.52 b 40.39 a 2%2.57 a 2.21 a 14.01 c 1.78 a 30.74 b 黄原胶 Xanthan gum 3%2.32 b 1.97 c 15.09 b 1.42 b 38.79 a 1%2.46 ab 0.88 b 64.23 b 0.00 b 100.00 a 2%2.55 a 1.05 a 58.80 c 0.02 a 99.25 a 轻质碳酸钙 Calcium carbonate 3%2.16 c 0.56 c 74.07 a 0.02 a 99.07 a 1%2.33 b 1.11 b 52.36 b 0.56 b 75.97 b 2%2.46 a 1.33 a 45.90 c 0.65 a 73.60 b 十二烷基苯磺酸钠 DBS 3%2.11 c 0.65 c 69.19 a 0.22 c 89.57 a CK1-2.48 a 2.48 a 0.00 b 2.22 a 10.50 b CK2-2.42 b 0.89 b 63.20 a 0.00 b 100.00 a 注：表中数据为平均值；不同字母表示不同用量间具有显著性差异(P0.05)。Note:Data in the table were mean value.Data with different letters indicated significant differences between different dosages(P0.05).2.6 紫外保护剂筛选 由表 6 可知，与 CK1（不加紫外保护剂，不照射）和 CK2（不加紫外保护剂，照射）相比，紫外保护剂的添加，可降低紫外胁迫下的芽胞存活率，当添加 1%的紫外保护剂，在 254 nm 紫外灯（20W）距离 40 cm处照射 12、24 h 后，以 1%抗坏血酸（VC）为紫外保护剂时的存活率最高，照射 12 h 时存活率为 71.43%，照射 24 h 时存活率为 59.52%，其次为糊精（1%）和海藻酸钠（1%），12 h 的存活率分别为 65.31%和 38.14%，24 h 的存活率分别为 36.73%和 4.24%。而十二烷基苯磺酸钠（DBS）的存活率最低。结合紫外保护效果与生物相容性试验结果，选择 1%抗坏血酸（VC）作为贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 可湿性粉剂的紫外保护剂。2.7 质量检测 将贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 发酵液与筛选所得并粉碎载体、润湿剂、分散剂、稳定剂、紫外保护剂等按优化后的配比同时混合，边搅拌边进行喷雾干燥制得贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 WP。对贝莱斯芽胞杆菌SH-1471 WP 进行质量检测结果如表 7 所示，根据检测测量值与质量检测标准值，贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 WP 细度、润湿时间、悬浮率、干燥减量、pH、活菌数以及杂菌率均符合质量检测标准值，可应用于植物病害的生物防治。2.8 储藏存活率检测 贝莱斯芽胞杆菌 SH-1471 可湿性粉剂经室温 4、25 连续储藏 180 d，每 10 d 测定依次芽胞存活率，测定结果如