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科研仪器学
流式细胞仪

生命科学是一门以实验为基础的学科，要做实验必然少不了仪器设备。仪器设备的好坏也是衡量一个实验室水平的重要标志之一。同学们已经进入大学二年级下的学习，会越来越多地接触到一些科研仪器，今天我们要讲的是其中之一----流式细胞仪。

图1 流式细胞仪及流式细胞图

1.1 流式细胞仪基本结构与功能
1.1.1 流式细胞仪基本结构
流式细胞仪(flow cytometer，FCM)是集现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备，是生命科学研究领域中先进的仪器之一。概括来说，流式细胞术就是利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。它具有如下几个特点：①实现对单列细胞或生物颗粒进行逐个检测。只要标本是单个细胞或生物颗粒，即可用于分析，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等，实体组织经处理后制成的单细胞悬液也能分析。②实现高通量检测。只要标本中的细胞或生物颗粒数量足够，短时间内可分析大量细胞或生物颗粒。流式细胞仪可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行检测，被检测的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。③多参数、多色荧光分析对细胞特性的识别、计数更为准确。用不同荧光素标记的单克隆抗体进行多色荧光染色，可同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征，使细胞特性的识别计数更为准确。④定性或定量分析细胞。通过荧光染色对单个细胞或生物颗粒的某些成分，如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性、细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。⑤分选特定性状或功能的细胞。有些流式细胞仪还具有细胞分选功能，可将具有特定性状或功能的细胞从混合细胞群中分离出来。总之，它具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点。
流式细胞仪的基本结构包括四大模块：流动室与液流系统、光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统。具有分选功能的流式细胞仪还包括分选系统。
1.1.1.1 流动室与液流系统
由于流式细胞仪的激发光路是固定的，一般与细胞悬液的轴心正交，这就要求细胞必须在流经激光聚焦区时不能偏离其轴心，且不能聚集成团，阻塞管路，否则光束无法准确照射细胞中心，造成信号不稳定，影响测量结果的精密度。流式细胞仪液流系统成功地解决了上述问题。根据层流原理(层流，laminar flow，是流体的一种流动状态。流体在管内流动时，其质点沿着与管轴平行的方向作平滑直线运动。此种流动称为层流或滞流，亦有称为直线流动的。流体的流速在管中心处最大，其近壁处最小。管内流体的平均流速与最大流速之比等于0.5)，利用专门设计的流动室(fIow cell)，使样本流与鞘液流形成同轴流动状态。由于样本喷嘴处于流动室中央，这就使得样本流在鞘液流包裹下恒定处于同轴流动的中心位置，其精度可稳定在几微米之内。流动室还根据Bernoulli定律，利用大小两个不同截面，使鞘液从截面积较大部分流经截面积较小的样本流部分，使液流聚焦在入口处，形成检测点。液流系统的心脏是流动室，由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用石英玻璃等透明、稳定的材料制作，设计和制作均很精细。样品管储放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度u<10 m/s(图2)。

图2 流动室液流原理与检测点

1.1.1.2 光源与光学系统
流式细胞仪的检测是基于对光信号的检测来实现的，包括对散射光和荧光的检测，因此光源与光学系统是流式细胞仪中最为重要的一个系统。它由激发光源、一系列光通过和光反射的镜片组成(图3)。

图3 光源与光学系统

(1)激发光源。目前流式细胞仪所用的激发光源包括弧光灯和激光器。弧光灯多为高压汞灯，激光器按产生激光的物质的种类可分为固体激光器、气体激光器、液体激光器和半导体激光器。各种激发光源应该说各有优缺点，没有哪种激发光源可以适于所有的场合，生产厂家在选择何种光源作为激发光的时候主要考虑：分析或分选目的、激发波长的需要、仪器设计等。作为流式细胞仪的激发光源，有两个特性是比较重要的：①单色性和单向性。单色性是指一种激光往往为某一波长的光；单向性是指激光的方向性相当好，几乎没有侧散射并且能进行远距离传播。激光作为流式细胞仪的激发光源，具有良好的单向性和单色性。当然，任何光源其发射波长都不仅仅是一个波长，都需要通过各种配套的光学组件来获得单色光。例如，氩离子激光器其实提供了488 nm和514 nm两条谱线，后者在应用时通过滤光片滤除；汞弧光灯可以筛选出很多波长的光，通过各种配套的光学组件，也可以取得不亚于单波长激光的单色性。②衰减。任何光源在使用时都会有功率衰减，因此都有寿命要求，对于气体激光器，汞弧光灯可以保用5000 h，半导体激光器可以保用8000 h。现有的流式细胞仪的激发光大概为两种波长，第一激光为488 nm，第二激光为633 nm。有些流式细胞仪还有第三、第四激光，分别为407 nm、355 nm。
(2)光学系统。流式细胞仪的光学系统是由若干组透镜、滤光片和分光镜等光学元件组成，它们分别将不同波长的光信号送入到不同的探测器。其主要光学元件是滤光片(filter)，它主要分为四类：长通滤光片(long-pass filter，LP)、短通滤光片(short-pass filter，SL)、带通滤光片(band-pass filter，BP)和二分镜。
长通滤光片：使特定波长以上的光通过，特定波长以下的光不能通过，如LP500滤片，允许500 nm以上的光通过，而500 nm以下的光则吸收或返回。
短通滤光片：与长通滤光片正好相反，使特定波长以下的光通过，特定波长以上的光则吸收或返回。
带通滤光片：可允许相当窄范围内的波长通过。滤片一般有两个值，一个为允许通过波长的中心值，另一个为允许通过波长的范围。例如，BP500/25表示允许通过的波长范围为475～525 nm，其中心值为500 nm (图4)。

图4 各种透镜示意图

二分镜：二分镜分短通二分镜和长通二分镜。长通二分镜(dichromatic LP，DLP)只允许某一特定波长以上的光通过，此波长以下的光则呈90o反射；短通二分镜(dichromatic SP，DSP)只允许某一特定波长以下的光通过，此波长以上的光呈90o反射(图5)。

图5 二分镜示意图

1.1.1.3 信号收集与光电转换系统
流式细胞仪的信号收集与光电转换系统主要由光电转换器件、放大器和信号处理电路组成。
(1) 光电转换器件。光电转换器件的主要功能是将光信号转换成电流信号。在流式细胞仪中，光电二极管和光电倍增管(PMT)执行此功能。PMT的转换效率要远远大于光电二极管。对于光电二极管来说，如果有10个入射光子，产生的电子数量不会超过10个电子，但一个光子到达PMT的光电阴极时，可产生数十万个电子。当然，如果前置放大电路有足够的增益和低噪音的话，光电二极管所产生的信号更准确。
当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的PMT或光电二极管，将光信号转换成电信号，然后输入到放大器放大，供信号处理系统处理。放大器分两类：线性放大和对数放大。检测细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等时，一般选用线性放大测量；而在检测细胞膜表面抗原等时，细胞膜表面抗原的分布有时相差几十倍，甚至几万倍，如用线性放大器，无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来，通常需使用对数放大器。如果原来输出是1，当输入增大到原来的10倍时，输出为2；当输入增大到原来的l00倍时，输出为3等。
信号处理电路的主要功能是将电信号转变成脉冲信号、数字信号最终传送给计算机系统进行处理。它主要由前置放大电路、脉冲峰值检测器和模/数转换电路组成。理论上，模/数转换芯片的位数和速度决定了数字信号的精度，模/数转换芯片的位数和速度越高，仪器精度就越高，但同时要考虑噪声信号的水平。
(2) 计算机与分析系统。流式细胞仪的计算机系统用于控制整个仪器的运行、数据采集和数据分析。各公司所产的流式细胞仪都有自己特有的分析系统，如BD公司的Cellqust、FACSDiva分析系统和Beckman Coulter公司的EXP、CXP分析系统。

1.1.2 流式细胞仪的基本功能与应用
流式细胞仪是检测细胞各种成分的重要细胞生物学工具，其基本功能是对各种粒子或细胞进行分析与分选。
1.1.2.1 定性或定量分析功能
流式细胞术不但可以定性、定量分析细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分，而且可以研究细胞的各种功能状态(如细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、氧化还原状态、吞噬性等)。目前通过液相芯片技术还可以定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分。
细胞膜：脂质双层分子结构中具有多种蛋白质分子----细胞表面抗原，表面糖类，表面受体，膜电位，膜结合钙离子，细胞表面电荷等，这对确定细胞的性质及其功能是十分重要的。
细胞质：各种细胞成分，包括蛋白质、RNA、各种细胞器中的特殊成分各种抗原、基因编码蛋白、细胞因子、细胞质内钙离子、pH值、各种基因表达蛋白、抗原蛋白等。
细胞核：DNA、RNA、蛋白质等。
可溶性成分分析：通过液相芯片技术可以定量检测血清中的各种可溶性生物分子
成分。
1.1.2.2 分选功能
借助流式细胞仪的分选系统，可将具有特定性状或功能的细胞从混合细胞群中分离出来，再进行分析或培养。它具有以下优点：①分选纯度高(可达99％)；②分选回收率高(可达90％)；③可分选活细胞，并可进行单细胞克隆。

1.2 流式细胞术的重要术语
1.2.1 前向散射与侧向散射
在流式细胞术中，由于细胞在未受到任何破坏的情况下对光散射是其固有属性，所以可利用细胞对光的散射信号的不同反应对细胞进行分析与分选。
细胞在鞘液流中通过激光照射-测量区，细胞向空间呈360o立体角方向散射光线，散射信号与细胞大小、形状、质膜以及细胞内颗粒结构的折射率有关。在流式细胞术中常被利用的有前向散射(forward scatter，FSC)与侧向散射(side scatter，SSC)。
前向散射也称小角散射，该值的大小与细胞的直径成近似直线关系，也就是说，对于 不同细胞，细胞越大，其FSC越大；反之则越小。侧向散射又称90o散射，它对细胞膜、胞质和核膜的折射更为敏感，其散射强度几乎与细胞内颗粒结构的质量成近似直线关系，也就是说，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，其SSC越大；反之则越小(图6、7)。

图6 FSC和SSC检测器

图7 光散射信号FSC、SSC与细胞大小、胞内颗粒结构的关系

1.2.2 Coulter效应与电子体积
Coulter效应原理：微小粒子(包括细胞)并不导电，但通过充满电解液的特殊小孔时可产生电阻变化，细胞的体积越大，电阻的改变就越大。利用这种原理将电阻变化记录为电位变化，应用于微小粒子的体积测量和计数上。采用这种方法计算该颗粒的体积就是电子体积。目前，库尔特贝克曼公司开发了应用电子体积与侧向散射组合代替FSC与SSC组合来对样品进行分群的新技术。

1.2.3 荧光信号及其面积与宽度
光线是一种由光子组成的能量形式，光线的颜色(波长)与光线的光子能量高低相关。光线的能量随着波长的递增而减弱，波长越短，能量越高；波长越长，能量越低。蓝光的波长为400～500 nm，而红光的波长为600～650 nm，其他可见光(绿、黄和橙)的光谱落在两者之间。原子由原子核(质子和中子)和沿核周轨道运动的外层电子组成，一个电子可以在任何的轨迹上运动，这取决于这个电子所携带的能量。在基础态电子轨道上运动的电子吸收能量(可以是光子携带的能量)后而转移到外层激发态电子轨道上运动，而在激发态电子轨道上运动的电子返回基础态轨道时，释放能量并散射出荧光，这就是荧光产生的机制。一种物质的吸收光谱(absorption spectra)取决于这种物质的原子中的基础态轨道电子跃迁到激发态轨道所需要的能量，而荧光的发射光谱(emission spectra)则取决于电子由激发态轨道返回到基础态轨道所释放的能量。由于电子从激发态轨道返回到基础态轨道时，部分能量以热能的形式释放，这就是一种荧光物质的吸收光波长总比所散射的荧光波长小的原因。
经染色后的细胞通过激光照射-测量区，在激光照射下，荧光染料吸收能量发生能量跃迁，在短暂的延迟后回到基态并发出荧光，产生的荧光信号被特定波长的双色性反射镜和带通滤光片组成的一组光学元件传递到信号收集器中(光电倍增管，PMT)收集，形成信号脉冲。每一个信号脉冲都有其高度、面积与宽度(图8)。每种颜色的荧光占用一个特定波长的检测器，每种颜色的检测器称为一个荧光通道(fluorescence channel)(图9)。

图8 荧光信号脉冲的面积、高度与宽度

图9 荧光信号和荧光通道

荧光信号脉冲高度表示荧光信号的强度，表示为FLn-Height，n为仪器的荧光信号收集器序数，如第1色荧光脉冲高度表示为FLl-Height。
荧光信号脉冲面积是采用积分计算的荧光通量。一般对DNA倍体分析时采用面积与宽度，如第2色荧光信号脉冲面积(FL2-A)、宽度(FL2-W)，其他分析则一般采用脉冲高度。这是因为荧光脉冲面积比荧光脉冲高度更能准确地反映DNA含量。形态差异较大而DNA含量相同的细胞，其被检测的荧光脉冲高度(FL2-Height)是不等的，而荧光脉冲面积(FL2-A)则相等。
荧光信号脉冲宽度(FL2-W)反映荧光的分布，常用来区分双连体细胞。由于DNA组织样本中的细胞容易聚集、粘连，当两个G1期细胞粘连在一起时，其测量到的FL2-A与一个细胞的G2/M期是相等的，导致测量数据中G2期细胞比例会增加，影响测量数据的准确性。但连体细胞的FL2-W则要大些(图10)，用流式细胞术分析DNA倍体时，通常应选FL2-W将连体细胞区分开来(图11)。

图10 双连体细胞与单细胞形成的荧光信号脉冲比较
(右图为用荧光宽度与面积区分双连体细胞，R1为双连体细胞)

图11 双连体细胞在细胞周期与细胞凋亡(亚G1峰)中的应用
(图上为排除双连体细胞周期分析图。Dip G1：53.91％；Dip G2：24.00％；Dip S：22.08％；G2/G1：1.74。图下为未排除双连体的分析图。Dip G1：49.53％；Dip G2：28.73％；Dip S：21.4％；G2/G1：1.77。可见双连体对细胞周期的影响)

1.2.4 光谱重叠与荧光补偿
流式细胞仪是通过内置的激光器发射激光激发荧光染料，通过荧光将488 nm或其他波长的光转变为另一波长的光，并通过光电倍增管或光电二极管将光信号转变为电信号或数字信号，并由计算机统计处理为可读数据。用激光束激发两种或两种以上荧光物质而发出不同波长的荧光，从理论上来讲，可以选择光学组件将它们分开，仅使一种荧光被一种荧光探测器收集处理，而检测不到另外一种荧光。实际上由于荧光素的激发或发射波长是正态或偏态曲线，即有很宽的范围，荧光素之间的波谱常有重叠现象，如FITC、PE的发射波长均为偏态分布，FITC受激发后将光源多数转变为525 nm左右的光，而PE则多数转变为575 nm左右的光，但两者波谱有重叠的情况，因而FITC荧光探测器会检测到由PE发射的575 nm左右波长的光信号，同样，PE探测器也可检测到由FITC发射的525nm左右波长的光信号，只不过每一个荧光探测器检测到的荧光信号以一种荧光为主而已。此时就需要进行一系列仪器设置，去除这部分干扰。流式细胞仪在设计时就加入了电子补偿系统，去除因光谱重叠而进入其他荧光探测器的荧光信号，这个过程叫荧光补偿。补偿的程度一般要根据当时仪器状态与各荧光脉冲强度来决定。
荧光补偿分人工补偿与自动补偿。例如，检测FITC与PE双标，人工补偿时，先测定FITC染料，此时除接收该荧光的光电倍增管1(FLl)应该有信号外，另一个光电倍增管(FL2)也可检测到微弱的荧光信号，这时需要调节补偿系统，将FL2检测的荧光信号调至阴性区域(即零信号)。在检测第二种荧光染料PE时，将FLl检测的荧光信号调至零信号。自动补偿系统则是新一代流式细胞仪(如LSR-II、FC-500等)预先在机器中装载数字信号处理器(DSP)，采用数字化荧光波长分布分析技术与高级数字化校正技术，完成全矩阵荧光自动补偿，不需人工调节，操作更为简单、方便。由于采用全矩阵自动补偿技术，还可以实现在离线状态下完成补偿功能，即检测时不进行荧光补偿或补偿不好，在检测完毕后，仍可以进行补偿与分析。如图12所示为FITC与PE双标记荧光补偿的补偿原理与过程。

图12 FITC与PE双标记荧光补偿示意图

1.2.5 细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间
按测量不确定度的定义合理赋予被测量之值的分散区间包括全部被测量的测量结果，即测量结果100％存在于这一区间。这一分散区间的半宽一般用a表示。由随机样本计算得到的参数估计值可能在未知真值的附近变化。对于任意给定的估计值，我们可以找到一个可能包含真值a的双边置信区间:aL合，在流式细胞仪上可检出一定的信号，这部分的信号称为基础荧光域值。根据置信区间的原理，在流式标本的检测过程中，通常需要通过调节电压将阴性细胞的基础荧光域值置于95％或99％的置信区间内，作为阴性对照可信区间设定，即在阴性对照组的直方图或散点图中，基础荧光域值设定在阴性分布的最左端或下端，包括95％～99％的数据。可能有1％～5％的阴性对照组的数据会出现在游标的右侧或上端，则被认为是阳性数据，一般是非特异性信号。随后的检测样本将比照这个阴性对照可信区间，确定其分析结果的阴性或阳性比例。有时候直方图的单峰可能是正态分布，也可能不是正态分布，分析的区域是围绕峰值而选定的。与这一区域相关的统计学数据是均数或中位数，后者直接对应于被统计的平均荧光强度(mean fluorescence-intensity，MFI)。在此处理过程中，用阴性对照组与实验组的MFI进行比较(图13)。

图13 阴性对照组与实验组的MFI进行比较

1.3 流式细胞术基本原理
1.3.1 流式细胞术分析的基本原理
前面我们谈到两组重要术语：前向散射、侧向散射与荧光信号。前向散射与侧向散射是细胞固有的属性，暂称为物理属性。前向散射(FSC)的大小与细胞的直径成正相关，也就是说，细胞越大，其前向散射越大；反之则越小。侧向散射(SSC)的强度几乎与细胞内颗粒结构的质量成正相关，也就是说，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，其SSC越大；反则越小。荧光信号则是人们通过不同的手段将荧光物质结合在细胞上，是人为的属性，暂称为化学属性，通常代表了试验者检测目的。流式细胞仪就是通过这两种属性将细胞进行分群、分析的。
检测一个不同类质细胞的混合样品时，每个细胞在液流中通过激光照射-测量区，都会被信号探测器检测到其物理属性。由于同一类质的细胞具有相同或相近的直径大小和颗粒结构，所以应该具有相同或相近的FSC与SSC。那么，在以FSC作为横坐标，SSC作为纵坐标的散点分布图中(这只是一个习惯的标识法，也可以FSC作为纵坐标，SSC作为横坐标)，同一类质的细胞会根据其FSC与SSC的大小(也即细胞直径和颗粒、结构、质量的大小)以散点的形式集中分布在某一区域中，每一个散点代表一个该同一类质的细胞。同样，其他同类质的细胞也会根据其FSC与SSC的大小分布在分布图中，这样就可以将混合细胞进行分群(图14)。当然检测标本千差万别，其FSC与SSC也会或大或小，这时需要通过调节PMT增益，使每群细胞都分布在坐标图中的可视范围内。

图14 利用FSC/SSC可将混合细胞进行分群
(为外周血白细胞的分群情况。由于淋巴细胞体积较小，细胞内颗粒少，故其分布处于FSC、SSC都较小区域，即R1区；粒细胞体积较大，细胞内颗粒最多，故其分布处于FSC大、SSC最大的区域，即R3；单核细胞体积较大，细胞内颗粒较粒细胞少，故其分布处于二者之间；R4为红细胞裂解碎片和少量血小板等)

利用细胞自身的物理属性可对混合细胞进行分群并可找到欲检测的目的细胞，那么如何确定欲检测的目的细胞是否表达荧光信号呢?这时需要先将欲检测的目的细胞群圈定(即设门)，然后将门内的细胞以FSC或SSC为横坐标、荧光信号为纵坐标的散点分布图表示出来。在此图中，细胞会出现在与其FSC或SSC大小相应的位置，并只可能表现出两种情况：荧光信号弱或无、荧光信号强或有(图15)。

图15 通过光散射R1设定，理论上细胞表面FITC表达情况
(左图为R1区内细胞群FITC信号弱或无的模式图(98％左右在Q3内，Q1为非特异性信号)图中、图右为R1细胞群区内FITC信号有或强的模式图(Q1))

图16 通过调整电压可以使荧光信号增强或减弱
(荧光信号可以因调节电压的大小而改变；图左为阳性标本；图中为减小电压，平均荧光信号强度降低，阳性率降低；图右为增大电压，平均荧光信号强度增强，从而使gating无法精确画出)

如图16所示，调节PMT增益(电压)可以改变目的细胞的荧光信号强弱，那么如何判断特异性荧光信号的有无?这就需要设置阴性对照以确定细胞自身的基础荧光域值，并通过它来判断待测样本中是否有特异性荧光信号。当荧光素或荧光特异性抗体与待测细胞反应后，流式细胞仪会检测到两部分信号：一部分是细胞自身的基础荧光域值；另一部分是标记在细胞上的荧光素信号，即特异性信号，这部分的荧光信号强度大于基础荧光域值的荧光信号强度。为确定特异性荧光信号，首先通过调节电压，将阴性对照细胞的基础荧光域值调至阴性置信区内，然后对阴性置信区进行界定，大于阴性置信区的荧光信号即为特异性荧光信号。习惯上，为后期分析作图时美观好看，阴性置信区一般设定在散点图中的左下象限，直方图中的荧光强度的101区内(BD FACScalibur流式细胞仪)；当然，只要机器电压允许，不影响阳性信号的显示，也可以设定在102、103区内。流式细胞仪阴性置信区的界定是通过“四象限或M1的划分”来实现的。在散点图中为四象限的划分区间，在直方图中为Maker(M1或P1)。因此，对于一个流式样本来说，设置阴性对照是必须的，且阴性置信区的界定一旦设定，将作为后续样本的阴、阳性判断的基础，不能随意变动(图17、18)。

图17 通过阴性对照的基础荧光阈值界定阴性置信区

图18 通过与阴性对照比对，确定为特异性阳性信号
(图左为阴性对照，通过调节电压将其基础荧光域值调节至阴性置信区内(Q3)并界定阴性置信区，Q1为少量非特异性信号，一般小于1％～5％；图右为样本，通过与阴性对照比对，大于基础荧光域值的荧光信号(Q1)确定为特异性阳性信号)

1.3.2 流式细胞术分选的基本原理
流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。其总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其他液体被当做废液抽吸掉。某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选。
稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十千赫兹的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约数百微米。经验公式f=u/(4.5d)给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中，u是液流速度，d为喷孔直径。由此可知，使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果，使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选+150V或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定、经逻辑选择、再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十毫秒。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟，也可根据具体要求予以适当调整(图19)。

图19 流式细胞木分选基本原理

1.3.3 流式细胞仪荧光补偿设置
前面我们已谈过由于荧光光谱的重叠现象，在进行多色分析时，必须进行荧光补偿。由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路的处理，所以任何波长的光信号可被转化为任何强度的电信号。同时又因为补偿电路在放大电路的后面，故补偿强度将由两个部分决定：原荧光探测器的信号和漏进其他探测器的信号。补偿最终要达到的效果是：漏进其他探测器的信号-原荧光探测器的信号×n％=0。由此，补偿的强度将随着各荧光探测器的放大倍数(电压)的变化而变化，特定的电压对应特定的补偿参数。
要确定补偿强度，需运用以上补偿的基本原理并结合特定的标本来实现。以FITC、PE双色分析为例，加以说明。
(1) 先调节阴性对照管(即同型对照IgGFITC/IgGPE)：先将原补偿清零，通过调节电压，使阴性群落在FITC和PE双阴性区。阴性对照在此处的作用是，调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。
(2) FITC标记抗体/IgGPE：在理想情况下(没有荧光干扰)，因检测管中不应该出现PE信号(IgGPE为同型对照，与阴性对照一样)，但实际情况是在PE坐标上出现了荧光信号。这个信号就是PE探测器检测到的FITC信号。此时就需要通过调节补偿参数，取合适的补偿强度来抵消PE中的信号(图20)。此时的电压已通过阴性对照设定，绝对不能变动。当PE探测器检测到的FITC信号恰好完全消除时，即PE信号与阴性对照一样时，此时的补偿便是正确的，即FITC单阳性细胞的PE信号与阴性对照的PE信号一致。

图20 FITC对PE的荧光补偿

由图可知，调节补偿条件首先要知道双阴性细胞的情况，其次是在检测管中，必须要有FITC单阳性细胞和双阴性细胞，只有这样才能在本底的参照下将进入PE探测器的FITC信号降至本底一致，不会过多或过少地进行补偿。
(3) IgGFITc／PE标记抗体：同理，将进入FITC探测器的PE信号降至本底一致，前提是必须要有PE单阳性细胞和双阴性细胞。
(4) 当设置好以上补偿条件后，即补偿调节完毕(图21)。

图21 荧光补偿设置

(5) 进行多色分析时，必须做各荧光间的补偿。方法同上，先准备各种标记的荧光阴性对照，确定合适的电压，并逐一调节各荧光标记抗体，与其他荧光对照，然后调节特异性荧光对每个荧光的补偿。在许多实际检测工作中，遇到某一标志物进行设门的情况，此时最终观察的是单参数结果而非双参数结果，所以往往可忽略其中某一荧光的补偿问题。在这种情况下调节的方法又略有不同，但万变不离其宗，只要清楚地理解补偿的形成与调节机制，便能解决问题。

1.4 流式细胞术的样本设置
根据流式细胞术的基本原理可知，设置对照是必须的，但是在我们实际检测的过程中，很多操作者并不设置对照或不知怎样设置对照，因此，下面介绍流式细胞术中的常用对照设置是有必要的。
1.4.1 常用对照
1.4.1.1 阴性对照
阴性对照的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，将仪器归零，即确定待测标本的基础荧光域值。
(1) 免疫球蛋白同型对照。同型抗体为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2。同型对照就是使用同型抗体进行平行实验，反映待测标本对抗体非特异性结合的水平。例如，使用的荧光抗体为FITC标记、鼠IgG1亚类抗体，那么其同型抗体应该为FITC标记、鼠IgG1亚类同型抗体。同型对照可以根据染色方法这样设置：①对于直接免疫荧光染色标本，建议选择试剂公司提供的与抗体配套的同型抗体作为阴性对照；②对于间接免疫荧光染色标本，设置以同型抗体作为一抗再加荧光二抗的平行管作为阴性对照。若当时无同型抗体，则至少需设置只加二抗、不加一抗作为阴性对照。
(2) 封闭抗体对照。由于有些细胞高表达Fc受体(FcR)，如DC、B细胞等，能够通过其FcR与特异性荧光抗体结合，造成其基础荧光域值比较高，影响实验结果的精确性。封闭抗体对照常用于检测某些低表达分子、而该细胞高表达Fc受体的实验。封闭抗体一般为未标记的羊IgG、鼠IgG。封闭抗体对照即用封闭抗体预先与待测细胞共孵育，以阻断待测标本对特异性荧光抗体的非特异性吸附作用，降低待测标本的基础荧光域值。
(3) 阴性细胞对照。阴性细胞对照即用已知不表达某种抗原的细胞(阴性细胞)进行平行实验，通常用于确定抗体的特异性。
(4) 正常血清或IgG对照。正常血清对照多用于间接免疫荧光标记技术中。在间接荧光标记过程中，第二抗体多用荧光标记多克隆抗体(如荧光标记的羊抗鼠IgG、大鼠抗小鼠IgG等)。对于某些检测的样本，这些二抗与样本非特异性结合比较高，可能造成其基础荧光域值比较高，影响结果的精确性和灵敏度。为排除这部分干扰，可选用二抗来源动物的正常血清或IgG封闭非特异性结合，降低其基础荧光域值。操作步骤：先加一抗，再加正常血清或IgG，最后加荧光标记的二抗。
1.4.1.2 阳性对照
阳性对照即用已知表达某种抗原的细胞(阳性细胞)进行平行实验，通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。如果阳性对照呈阴性或阳性减弱，提示抗体的滴度、特异性可能有问题，也可能是实验方法的问题，如试剂、操作不当等。
1.4.1.3 空白对照
空白对照即不进行标记的细胞。有些细胞胞内物质会同样被激发而产生自发荧光，如肿瘤细胞、含颗粒较多的细胞或长期培养的细胞等有相对较强的自发荧光。空白对照主要用于确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。
1.4.1.4 补偿对照
由于荧光光谱的重叠，对于多色分析样本必须设置补偿对照。补偿对照主要用于多色分析时荧光光谱重叠的补偿调节。补偿对照是将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本反应，一一进行单色标记，以测定荧光信号的重叠并作适当调节。

1.4.2 一套完整的流式细胞术检测样本设置
流式细胞术的基本原理是利用细胞标记前后的荧光强度改变来确定细胞性状，故一套完整流式检测样本既要有用于确定其基础荧光域值的对照(如空白对照或阴性对照)，又要有已标记的待测样本。一套完整的流式细胞术检测样本设置可根据其不同的标记方法进行如下设置。
1.4.2.1 直接标记样本
对于直接标记单色样本，应该设置空白对照、阴性对照(同型抗体对照)和待测样本(最好还要阳性对照)。对于直接标记多色样本，在单色基础上另加补偿对照。
1.4.2.2 间接标记标本
对于间接标记单色样本，应该设置空白对照、阴性对照(一抗同型抗体对照)和待测样本(最好还要阳性对照)。在实际工作中若无一抗的同型抗体对照，则至少应该设置不加一抗、只加二抗作为阴性对照来代替。对于多色样本，在单色基础上另加补偿对照，但一般不建议使用。

1.5 流式细胞术的数据分析
流式细胞仪测定样品时，针对每个细胞都会记录其各自属性(包括物理属性和化学属 性)的检测数据，并通过模/数电路转换后将全部检测结果传送到计算机进行储存和作进一步的分析。
FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则根据研究者所要解决的具体问题而定。
1.5.1 数据显示与分析
FCM的数据显示方式包括单参数直方图(histogram)、二维点图(dot plot)、二维等高线图(contour)、假三维图(pseudo 3D)和列表模式(1ist mode)等。
1.5.1.1 单参数直方图
单参数直方图是一维数据用得最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X-Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型的不同，横坐标可以是线性标度或对数标度，单位用“道数”(channel)来表示，实质上是代表所测的荧光或散射光的强度。纵坐标表示的是横坐标某一特定荧光强度的细胞频数，一般为细胞的相对数，而非绝对数(图22)。利用直方图来“设门”进行分析，可得到细胞数目(events)、门内细胞的百分比(％gated)、占检测细胞总数的百分比(％ total)、平均荧光强度(mean)、几何均数、荧光强度的中位数(median)、峰值道数(peak Ch)以及荧光变易系数等统计参量。总的来说，单参数直方图只能表示具有同一特征细胞的数量及其荧光信号的强度。

图22 DNA含量与抗原表达的直方图
(图左为细胞DNA含量的检测(细胞周期分析)；图右为抗原APO2.7表达情况)

直方图技巧：①先看横、纵坐标，了解检测目的，纵坐标代表细胞数。例如，图22中图(a)表示检测细胞的DNA含量，图22(b)表示检测抗原APO2.7的表达，检测物是用PE标记的。②看图形分布，直方图的峰形越往右移，代表其荧光强度越强。例如，图23中(b)、(c)，在M2区域细胞的荧光强度要高于M1区域细胞的荧光强度。③M1的确定是根据阴性对照细胞的基础荧光域值设定的，峰形右移，荧光信号大于基础荧光域值(M1)，表示阳性(M2)。④数据统计时，检测目的物一般用各Marker区内的细胞所占百分比或用平均荧光强度表示。⑤几个直方图的比较，关键看Marker(M1、M2)的位置以及细胞数。

图23 直方图的数据处理与统计分析

1.5.1.2 二维散点图
二维散点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横坐标和纵坐标分别代 表与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示具有相应坐标值的细胞。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于两个一维直方图的信息量。所谓兼并就是多个细胞具有相同的二维坐标，在图上只表现为一个点，但细胞点密集的地方就难以显示它的精细分布。
散点图是一种双变量描述，可被分为四象限，可以产生至少四种可能的结果来明确地区分阴性和阳性。其结果用整个散点图中出现在特定象限的细胞占全部细胞的百分率来表示，每个点表示一个单独事件(一个细胞或一个微粒)，能反映流式细胞仪所测量和记录该事件的多种性质。这四个象限分别用LL、UL、UR、LR表示。
LL(左下)：表示对于X轴、Y轴所代表的参数呈现双阴性的细胞。如图24所示，表示CD4、CD3双阴性的细胞。
UL(左上)：表示对于Y轴所代表的参数呈现阳性反应，而对于X轴所代表的参数呈现阴性反应的细胞。如图24所示，表示CD4+，CD3-细胞。
UR(右上)：表示对于X轴、Y轴所代表的参数呈现双阳性的细胞。如图24所示，表示CD4+，CD3+双阳性的细胞。
LR(右下)：表示对于X轴所代表的参数呈现阳性反应，而对Y轴所代表的参数呈现阴性反应的细胞。如图24所示，表示CD4-，CD3+细胞。
看散点图技巧：①必须先看X轴、Y轴，了解X轴、Y轴各自所代表的参数的意义；②再看其四个象限，并了解各象限意义；③比较几个散点图时，关键看四象限划分区间的位置以及各象限散点的密度；④数据统计时，检测目的物一般用各象