氨基酸衍生物结合试验在化妆品检测中的应用.pdf

1166第 53 卷第 10 期2023 年 10 月Vol.53 No.10Oct.2023日 用 化 学 工 业（中英文）China Surfactant Detergent&Cosmetics Received:September 29,2022;Revised:September 25,2023.*Corresponding author.Tel.:[phone],E-mail:xiaol_.海关总署科研项目（2020HK211）DOI：10.3969/j.issn.2097-2806.2023.10.007Application of amino acid derivative reactivity assay for skin sensitization prediction of cosmeticsShixuanDing,XiaolinLi*,YuChen,JieYu（Technical Center for Animal,Plant and Food Inspection&Quarantine of Shanghai Customs,Shanghai 200135,China）Abstract:A laboratory method of amino acid derivative reactivity assay（ADRA）was established and validated based on the OECD guideline.Meanwhile,the possibility of applying ADRA to predict skin sensitization in cosmetic products was also evaluated.According to the guidance of OECD 442C,test substances（including chemicals and toners）were incubated with cysteine and lysine derivatives at a ratio of 501,respectively,in the dark for 24 h.The amino acid derivatives consumptions were analyzed by high performance liquid chromatography（HPLC）.The percent depletion was calculated,and each chemical was classified into sensitizers and non-sensitizers using the ADRA prediction model.The same test substances were applied to an ADRA commercial kit.The results show that,13 chemicals are correctly classified by ADRA as sensitizers or non-sensitizers.The results obtained in the lab are consistent with LLNA data,OECD TG 442C and the results of the commercial kit.Four toners are identified by ADRA as sensitizers and one as non-sensitizer.Key words:cosmetics;amino acid derivative reactivity assay（ADRA）;skin sensitization;alternative methodsSkinsensitisationadverseoutcomepathway（AOP）sensitizerschallengeT-cell proliferationbindingofsensitizersto skin proteinsactivation of dendritic cellsinflammatory responses of keratinocytesADRA1167第 10 期开发与应用丁诗璇，等：氨基酸衍生物结合试验在化妆品检测中的应用 过敏性接触性皮炎是皮肤对外源物质产生的免疫原性皮肤反应。传统的皮肤致敏试验包括豚鼠局部封闭涂皮试验和最大值试验。近年来欧盟国家全面禁止化妆品及化妆品组份的动物实验，非动物替代方法的研发和应用变得尤其重要。2007年“21世纪毒性测试：愿景与策略（Toxicity Testing in the 21st Century，TT21C）”的发表推动了有害结局通路（adverse outcome pathway，AOP）的研究和应用。皮肤致敏的AOP通路见图1，其分子起始事件是外源物质渗入表皮层与皮肤蛋白共价结合形成半抗原复合物，随后角质形成细胞激活发生炎性反应，同时被激活的树突状细胞迁移至局部淋巴结，将半抗原复合物呈递至淋巴细胞，最终导致细胞的增殖和分化。当皮肤再次接触相同过敏原时进入激发阶段，触发炎性反应1。目前，基于AOP关键事件开发的替代方法有直接多肽结合试验（direct peptide reactivity assay，DPRA）2，氨基酸衍生物结合试验（amino acid derivative reactivity assay,ADRA）2，角质细胞ARE-Nrf2荧光素酶检测方法3，人细胞系活化试验（human cell line activation test，h-CLAT）4。ADRA是针对皮肤致敏AOP起始事件建立的体外替代方法，2020年ADRA被收录至OECD 442C指南。ADRA的检测结果与小鼠淋巴结试验（LLNA）数据一致性达到92%，不同实验室之间再现性良好2。2019年，Yamamoto等人5首次将ADRA应用于混合物的检测，Fujita等人6和Wanibuchi等人7将ADRA方法进一步改良，采用高效液相色谱荧光分析检测混合物，扩大了方法的应用范围。同年，Yamamoto等 人8将ADRA方法和其他体外替代方法组合运用预测皮肤致敏性。2020年，Imamura等人9尝试增加ADRA的受试物加样浓度，减少了检测结果的假阴性。目前国外ADRA对化妆品产品的致敏性检测的研究存在空白，国内也未见对ADRA方法的相关报道。本研究旨在转化和建立ADRA方法，进行实验室内部验证，并与商业化ADRA试剂盒检测结果进行比对。在此基础上，采用ADRA方法对化妆品配方进行致敏性检测，为ADRA在化妆品产品检测中的应用提供 依据。1 实验部分1.1 主要材料、试剂与仪器人工合成半胱氨酸衍生物（N-（2-（1-naphthyl）acetyl）-L-cysteine，NAC，分子量289.35，纯度98%）、赖氨酸衍生物（-N-（2-（1-naphthyl）acetyl）-L-lysine，NAL，分子量314.38，纯度98%），苏州强耀生物有限公司；商业化ADRA试剂盒，日本Fujifilm公司；乙腈（色谱纯）、三氟乙酸（TFA，分氨基酸衍生物结合试验在化妆品检测中的应用丁诗璇，李小林*，陈 瑜，于 婕（上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135）摘要：以OECD指南为基础，在实验室建立氨基酸衍生物结合试验（ADRA）方法并进行实验室内验证，同时评估该方法对测试化妆品配方致敏反应的可能性。依据OECD 442C指南，将受试物（包括化学品和化妆水配方）分别与半胱氨酸衍生物和赖氨酸衍生物以501的比例避光孵育24 h，采用高效液相色谱法分析两种氨基酸衍生物的消耗，计算氨基酸衍生物消耗率并依据ADRA预测模型对受试物致敏性进行判定。同样条件下使用商业化ADRA试剂盒按照操作规程检测相同受试物的致敏性。由试验结果可知，实验室建立的ADRA方法可以准确区分13种化学品的致敏性，检测结果与OECD 442C指南及文献中小鼠淋巴结试验（LLNA）结果一致，也与商业化试剂盒检测结果一致；ADRA对5种化妆水配方检测结果显示4种为致敏物、1种为非致敏物。关键词：化妆品；氨基酸衍生物结合试验；皮肤致敏；替代方法中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：2097-2806（2023）10-1166-07致敏物致敏物与皮肤蛋白结合二次激发T细胞激活树突细胞激活并呈递抗原角质细胞发生炎性反应图1 皮肤致敏的有害结局通路（AOP）Fig.1 Skin sensitisation adverse outcome pathway（AOP）1168第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）析纯）、无水磷酸二氢钠（分析纯）、无水磷酸氢二钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA 2Na 2H2O，分析纯），美国Sigma 公司。受试样品：对苯醌、二苯基环丙烯酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、反式肉桂醛、咪唑烷基脲、金合欢醛、甘油、2-丙醇、间苯二甲酸二甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醛、2，4-二硝基氯苯、乳酸，均为分析纯，美国Sigma公司。ACQUITY UPLC H-CLASS高效液相色谱仪，美国Waters公司，C18色谱柱（2.7 m，3.0 mm 150 mm），美国Waters公司。1.2 实验方法1.2.1 溶液配制配制pH 8.0的100 mmol/L磷酸盐缓冲液：将16 mL 100 mmol/L磷酸二氢钠溶液与300 mL 100 mmol/L磷酸氢二钠溶液混合，弃去17 mL溶液后加入1 mL 0.1 mmol/L EDTA溶液；配制pH 10.2的100 mmol/L磷酸盐缓冲液：称取4.26 g无水磷酸氢二钠加入到286 mL去离子水中，与14 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液混合；配制反应终止液：将2.5 mL三氟乙酸加入到100 mL去离子水中；配制高效液相色谱流动相A：1 mL三氟乙酸加入到1 L色谱纯水中；配制高效液相色谱流动相B：1 mL三氟乙酸加入到1 L色谱纯乙腈中。1.2.2 受试物处理依照表1配制5种自制化妆水溶液。受试样品（除自制化妆水外）均配制成浓度为1 mmol/L溶液。溶剂首选去离子水，若不溶解，可尝试溶解于乙腈、丙酮、二甲基亚砜。对苯醌、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、咪唑烷基脲、甘油、2-丙醇和乳酸的溶剂为去离子水，二苯基环丙烯酮、反式肉桂醛、金合欢醛、间苯二甲酸二甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2，4-二硝基氯苯和苯乙醛的溶剂为乙腈。自制化妆水直接使用原液。1.2.3 氨基酸衍生物处理配制6.667 mol/L NAC溶液：称取11.6 mg NAC溶解于20 mL磷酸盐缓冲液（pH 8.0）得到2 mmol/L NAC溶液，在149.5 mL磷酸盐缓冲液（pH 8.0）中加入0.5 mL 2 mmol/L NAC溶液，即得。配制6.667 mol/L NAL溶液：称取12.6 mg NAL溶解于20 mL磷酸盐缓冲液（pH 10.2）得到2 mmol/L NAL溶液，在149.5 mL磷酸盐缓冲液（pH 10.2）中加入0.5 mL 2 mmol/L NAL溶液，即得。1.2.4 空白对照、共洗脱对照、样品制备在96孔培养板中，NAC及NAL分别与受试物以150（5 mol/L氨基酸衍生物，250 mol/L受试物）比例混合，按表2加入试剂，混匀，每个样品、对照均平行制备3份。封板振摇混匀，将96孔板置（251）避光孵育（241）h后加入50 L反应终止液，用高效液相色谱进行检测。表1 化妆水配方成分Tab.1 Ingredients of toners组分w/%配方1配方2配方3配方4配方5水59.90067.90069.70069.88469.900酒精20.00020.00020.00020.00020.000甘油10.00010.00010.00010.00010.000吐温800.1000.1000.1000.1000.100肉桂醛10.0002.0000.2000.0160.000表2 空白对照、共洗脱对照及样品配制表Tab.2 Preparation of reference controls,co-elution controls and samples反应溶液V/LNAC溶液NAL溶液pH 8.0磷酸盐缓冲液pH 10.2磷酸盐缓冲液受试物溶液溶剂样品150 NAC15050150 NAL15050空白对照NAC15050NAL15050共洗脱对照NAC15050NAL150501.2.5 标准溶液配制将pH 8.0和pH 10.2的15 mL磷酸盐缓冲液分别与1 mL去离子水、100 L三氟乙酸和3.9 mL乙腈混合配制成稀释缓冲液。取15 mL 6.667 mol/L NAC/NAL溶液分别与1 mL去离子水、100 L三氟乙酸和3.9 mL乙腈混合配制成标准母液。将标准母液与稀释缓冲液等比例稀释混合配制成浓度为5.000，2.500，1.250，0.625，0.313，0.156和0 mol/L的标准曲线溶液。1169第 10 期开发与应用丁诗璇，等：氨基酸衍生物结合试验在化妆品检测中的应用 1.2.6 色谱条件柱温40，进样量10 L，流动相流速为0.3 mL/min，梯度洗脱，于281 nm处检测氨基酸衍生物的峰面积。高效液相色谱（HPLC）洗脱条件见表3。表3 HPLC梯度洗脱条件Tab.3 HPLC gradient elution conditions时间/minNACNAL（流动 相A）/%（流动 相B）/%（流动 相A）/%（流动 相B）/%0703080209.545555545100100101001301001010013.5703080202070308020氨基酸衍生物消耗率计算公式为：消耗率 1-（氨基酸衍生物反应的峰面积/空白对照的氨基酸衍生物峰面积）100%1.2.7 ADRA预测模型根据ADRA预测模型2对受试物进行判定（见表4）：判断受试物为非致敏物的阈值为4.9%，当平均消耗率4.9%时，受试物为非致敏物，当平均消耗率4.9%时，受试物为致敏物。当受试物与NAL发生共洗脱时，仅采用NAC消耗率进行判断，非致敏物的阈值为5.6%。表4 ADRA预测模型Tab.4 ADRA prediction model两种氨基酸衍生物 平均消耗率/%NAC消耗率/%ADRA预测结果4.90.990。NAC和NAL空白对照计算所得的浓度平均值在3.24.4 mol/L范围内，NAC和NAL的9个空白对照峰面积的变异系数CV分别为4.22%和2.48%。阳性对照（苯乙醛）的NAC消耗率为28.95%2.59%，NAL的消耗率81.70%4.28%。所有受试物NAC和NAL的消耗率的标准差SD小于10%。实验结果符合ECVAM（European Centre for the Validation of Alternative Methods）对ADRA方法建立的要求。13种化合物的ADRA检测结果见表5。其中5种化合物ADRA所得的结果小于4.9%，为非致敏物，8种化合物为致敏物，与LLNA结果一致2,15。由表6可知，ADRA实验结果与商业化ADRA试剂盒的检测结果一致，进一步验证了建立的ADRA方法的可靠性。受试物被分为致敏物和非致敏物的灵敏度、特异度和准确度均达到100%。其中乳酸是典型的具有刺激性但无致敏性的物质，表明ADRA对刺激性物质的检测结果不会出现假阳性。与同样基于皮肤致敏AOP起始事件的DPRA方法相比，ADRA方法的适用范围更广。在ADRA试验中，受试物溶液的配制浓度为1 mmol/L，可应用于溶解度较低的受试物，ADRA反应溶液中也基本不会出现沉淀。同时HPLC对NAC和NAL的检测灵敏度高，NAC和NAL含有的萘环在281 nm处有紫外吸收峰，在该波长下检测显著减少了与受试物来源的峰共出峰的可 能16，从而能够正确地评估受试物的致敏性。除此之外，ADRA方法使用96孔板和多通道移液器进行操作，并通过加入反应终止液抑制反应后再进行HPLC检测，可以得到更加准确和稳定的检测结果，是一种高通量、操作性优越的测试方法。1170第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）表5 ADRA结果与LLNA数据比较Tab.5 Comparison of ADRA prediction and LLNA data受试物NAC消耗率/%NAL消耗率/%氨基酸衍生物平均消耗率/%ADRA预测结果LLNA对苯醌100.000.0046.896.6473.45阳性极强致敏物二苯基环丙烯酮27.396.377.843.2117.62阳性强致敏物2，4-二硝基氯苯56.292.732.254.9929.27阳性极强致敏物2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮100.000.000.104.5550.05阳性中致敏物苯乙醛28.952.5981.704.2855.33阳性中致敏物反式肉桂醛100.000.004.113.7352.06阳性中致敏物金合欢醛20.043.033.481.0411.76阳性低致敏物咪唑烷基脲35.363.916.081.9420.72阳性低致敏物间苯二甲酸二甲酯4.814.511.450.433.13阴性非致敏物乳酸0.000.000.356.370.18阴性非致敏物2-丙醇4.675.580.624.272.65阴性非致敏物对羟基苯甲酸丙酯2.171.441.223.701.70阴性非致敏物甘油6.284.531.022.773.65阴性非致敏物表6 商业化ADRA试剂盒结果与ADRA结果比较Tab.6 Comparison of commercial kit and ADRA prediction受试物NAC消耗率/%NAL消耗率/%氨基酸衍生物 平均消耗率/%商业化ADRA 试剂盒预测结果ADRA预测结果对苯醌100.000.0048.945.9374.47阳性阳性二苯基环丙烯酮20.572.351.433.2311.00阳性阳性2,4-二硝基氯苯63.222.690.000.0031.61阳性阳性2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮100.000.000.661.9250.33阳性阳性苯乙醛20.667.0379.983.2750.32阳性阳性反式肉桂醛69.408.194.802.9437.10阳性阳性金合欢醛22.653.436.735.4514.69阳性阳性咪唑烷基脲34.705.011.733.6518.22阳性阳性间苯二甲酸二甲酯5.681.280.962.343.32阴性阴性乳酸2.596.835.254.133.92阴性阴性2-丙醇0.340.923.852.642.10阴性阴性对羟基苯甲酸丙酯4.316.950.000.002.16阴性阴性甘油0.000.000.532.520.27阴性阴性2.2 ADRA对不同化妆水配方的致敏性检测表7给出了ADRA和商业ADRA化试剂盒对分别含有10.000%，2.000%，0.200%，0.016%和0.000%的肉桂醛的5种配制化妆水检测所得的结果，ADRA和商业化ADRA试剂盒预测结果一致。表8给出了DPRA对化妆水检测结果与ADRA结果的比较，可以看到两种方法对含有0.016%肉桂醛的化妆水检测结果不一致。表7 化妆水的ADRA和商业化试剂盒检测结果Tab.7 Results of 5 toners by ADRA and commercial kit化妆水配方肉桂醛 含量/%ADRA商业ADRA化试剂盒NAC消耗率/%NAL消耗率/%平均消耗率/%预测结果NAC消耗率/%NAL消耗率/%平均消耗率/%预测结果110.000100.000.0037.365.2568.68阳性100.000.0039.253.6169.63阳性22.000100.000.0028.602.7164.30阳性100.000.0014.114.5657.06阳性30.200100.000.000.000.0050.00阳性100.000.000.000.0050.00阳性40.01629.244.340.000.0014.62阳性28.763.600.000.0014.38阳性50.0001.911.980.000.000.96阴性0.000.000.000.000.00阴性1171第 10 期开发与应用丁诗璇，等：氨基酸衍生物结合试验在化妆品检测中的应用 ADRA目前主要用于单一化学品或化妆品原料的致敏性评价，而我国的法规及标准要求对化妆品产品进行评价。为探索ADRA在化妆品检测中的应用，本研究以化妆水为代表，在化妆水的基本配方（包含水、甘油、酒精、吐温80）中分别添加10.000%，2.000%，0.200%，0.016%和0.000%的肉桂醛模拟致敏和非致敏化妆品样品，以此观察ADRA对化妆品或混合物中致敏物的剂量-反应关系的检测情况及检测灵敏度。肉桂醛是欧盟化妆品法规（EC1223-2009-EU Cosmetics Regulation-In Force）列出的26种香料致敏物之一，要求在不可冲洗型化妆品中含量大于0.001%时需要在标签上予以标注，我国境内淋洗类产品最高历史使用量为0.016%。本文采用建立的ADRA方法对5种化妆水进行检测，检测结果分别为致敏物、致敏物、致敏物、致敏物和非致敏物，氨基酸衍生物平均消耗率具有一定的剂量-反应关系，说明ADRA具有对化妆品产品进行预测的潜力。商业化ADRA试剂盒的检测结果与ADRA方法一致，DPRA的检测结果分别为致敏物、致敏物、致敏物、非致敏物和非致敏物。ADRA方法对肉桂醛含量为0.016%的化妆水的检测结果出现了假阳性，这可能是由于ADRA方法检测灵敏度更高，直接使用化妆水原液加样检测导致ADRA反应溶液中肉桂醛与氨基酸衍生物的比例增大，提高了二者的反应速率，从而增加了氨基酸衍生物的平均消耗率。在实际应用中，为提高检测结果的准确性，ADRA方法可与其他体外皮肤致敏检测方法如角质细胞ARE-Nrf2荧光素酶检测方法和人细胞系活化试验组合，采用“3选2”的整合测试策略（Integrated Testing Strategies,ITS）或是顺序测试序列（Sequential Testing Sequence,STS）预测致敏性8。当前体外化学方法对化妆品产品致敏性检测的挑战主要来源于三个方面，一是许多产品组分复杂，在HPLC检测中有可能与亲核试剂共出峰；二是对于混合物或未知组分的产品，摩尔质量计算较复杂甚至无法计算；三是对低浓度致敏成分的检测存在困难6。ADRA方法采用NAC和NAL，在281 nm处检测吸收波长能大大降低共出峰的可能。同时ADRA在致敏物浓度不低于0.05%时检测结果的准确率可达87.8%5，检测灵敏度高，意味着以质量浓度配制受试物溶液或直接使用受试物原液进行致敏检测具有可行性。当然，ADRA在化妆品产品检测中的应用还需要大量的实验数据积累，或者是实验条件的优化。3 结论本研究进行了ADRA方法在实验室的转化、建立、拓展。ADRA作为OECD认可的体外替代方法，适用于溶解度较低的受试物，高通量，对化学品皮肤致敏性预测结果与LLNA结果趋于一致，可作为第一步筛选试验，与其他体外替代方法组合运用。本研究采用ADRA对化妆品进行致敏性检测，表明了ADRA具有用于产品预测的潜力，拓展了该方法的应用范围，对国内法规的配合有现实意义。参考文献:1 OECD.The adverse outcome pathway for skin sensitisation initiated by covalent binding to proteins.Part 2:use of the AOP to develop chemical categories and integrated assessment and testing approaches.Series on Testing and Assessment No.168 R.Paris,2012.2 OECD.Test No.442C:key event-based test guideline for in chemico skin sensitisation assays addressing the adverse outcome pathway key event on covalent binding to proteins S.Organization for Economic Cooperation and Development,Paris,2021.3 OECD.Test No.442D:In vitro skin sensitisation:ARE-Nrf2 luciferase test method S.Organization for Economic Cooperation and Development,Paris,2022.4 OECD.Test No.442E:In vitro skin sensitisation:in vitro skin sensitisation assays addressing the adverse outcome pathway key event on activation of dendritic cells S.Organization for Economic Cooperation and Development,Paris,2022.5 Yamamoto Y,Fujita M,Wanibuchi S,et al.Expanding the applicability of the amino acid derivative reactivity assay（ADRA）:determining a weight concentration for preparation of test chemical solutions that yields a predictive capacity identical to the conventional method 表8 ADRA与DPRA检测结果比较Tab.8 Comparison of ADRA and DPRA results化妆水配方肉桂醛含量/%半胱氨酸多肽 消耗率/%赖氨酸多肽 消耗率/%多肽平均 消耗率/%反应程度DPRA预测 结果ADRA预测 结果110.000100.000.00100.000.00100.00高阳性阳性22.00082.602.2377.020.7579.81高阳性阳性30.20032.110.3411.431.3921.77低阳性阳性40.0161.110.160.000.000.56无阴性阳性50.0000.000.000.000.000.00无阴性阴性 1172第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）using molar concentration and demonstrating the capacity to detect sensitizers in liquid mixtures J.Journal of Pharmacological and Toxicological Methods,2019,97:67-79.6 Fujita M,Yamamoto Y,Wanibuchi S,et al.A newly developed means of HPLC-fluorescence analysis for predicting the skin sensitization potential of multi-constituent substances using ADRA J.Toxicology in Vitro,2019,59:161-178.7 Wanibuchi S,Yamamoto Y,Sato A,et al.The amino acid derivative assay with fluorescence detection and its application to multi-constituent substances J.The Journal of Toxicological Science,2019,44:821-832.8 Yamamoto Y,Fujita M,Wanibuchi S,et al.Applicability of amino acid derivative reactivity assay for prediction of skin sensitization by combining multiple alternative methods to evaluate key events J.Journal of Toxicological Sciences,2019,44:585-600.9 Imamura M,Wanibuchi S,Yamamoto Y,et al.Improving predictive capacity of the Amino acid Derivative Reactivity Assay test method for skin sensitization potential with an optimal molar concentration of test chemical solution J.Journal of Applied Toxicology,2021,41:303-329.10 Divkovic M,Pease C K,Gerberick G F,et al.Hapten-protein binding:from theory to practical application in the in vitro prediction of skin sensitization J.Contact Dermatitis,2005,53:189-200.11 Ahlfors S R,Sterner O,Hansson C.Reactivity of contact allergenic haptens to amino acid residues in a model carrier peptide,and characterization of formed petide-hapten adducts J.Skin Pharmacol Appl Skin Physiol,2003,16:59-68.12 Wareing B,Urbisch D,Kolle S N,et al.Prediction of skin sensitization potency sub-categories using peptide reactivity dataJ.Toxicology in Vitro,2017,45:134-145.13 Fujita M,Yamamoto Y,Tahara H,et al.Development of a prediction method for skin sensitization using novel cysteine and lysine derivatives J.Journal of Pharmacological and Toxicological Methods,2014,70:94-105.14 Yamamoto Y,Tahara H,Usami R,et al.A novel in chemico method to detect skin sensitisers in highly diluted reaction conditions J.Journal of Applied Toxicology,2015,35:1348-1360.15 Urbisch D,Mehling A,Guth K,et al.Assessing skin sensitization hazard in mice and men using non-animal test methods J.Regulatory Toxicology&Pharmacology,2015,71:337-351.16 Fujita M,Yamamoto Y,Wanibuchi S,et al.The underlying factors that explain why nucleophilic reagents rarely co-elute with test chemicals in the ADRA J.Journal of Pharmacological and Toxicological Methods,2019,96:95-105.（编辑：杨 旭）