白果内酯对多囊卵巢综合征大鼠模型的干预作用.pdf

中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 32 卷第 3 期2023 年 6 月Vol.32.No.3June.2023收稿日期2023-03-05 修回日期2023-06-09作者简介刘雨，女(1979 年)，汉族，主治医师*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：白果内酯对多囊卵巢综合征大鼠模型的干预作用刘雨1，于国新2，王晓霜1（1重庆市中医院产科，重庆 400021；2成都医学院第一附属医院妇科，成都 610500）摘要目的 探讨白果内酯（bilobalide，BB）对多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）模型大鼠的干预作用和机制。方法 60 mg/kgd 脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone,DHEA）连续 21 d 皮下注射法制作 PCOS 大鼠模型。造模后，每天大鼠腹腔注射 BB（50 mg/kg），持续 3 周。阴道涂片法检测大鼠动情周期变化；ELISA 试剂盒检测血清中的胰岛素、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P4）水平和卵巢组织中 TNF-、IL-1、IL-10、IL-18 水平，并计算胰岛素抵抗指数；HE 染色观察卵巢组织病理学，荧光染色检测卵巢组织中 ROS 水平，免疫组化染色检测SOCS3 和 p-STAT3 在卵巢组织中的表达。结果 在 PCOS 模型大鼠中，动情周期紊乱，卵巢组织学结构异常，血清 FSH、LH和 P4 水平明显增高，E2 水平明显降低，卵巢组织中 TNF-、IL-1 和 IL-18 等促炎因子水平增加，IL-10 的水平下降，ROS在囊性卵泡中明显集聚，空腹胰岛素升高，HOMA 稳态模型胰岛素抵抗指数增加，SOCS3 免疫染色显著减弱，p-STAT3 免疫染色显著增加；BB 处理显著减轻 PCOS 模型大鼠上述变化。结论 BB 可能通过降低雌激素、胰岛素、氧化应激和炎性水平以及抑制卵巢中 JAK/STAT3 信号活性来发挥对 PCOS 大鼠的治疗作用。关键词白果内酯；多囊卵巢综合征；炎症；氧化应激；激素调节；胰岛素抵抗；JAK/STAT3 信号中图分类号R711.75 文献标识码A DOI：10.16705/ki.1004-1850.2023.03.005Intervention effect of bilobalide on a rat model of polycystic ovary syndromeLiu Yu1,Yu Guoxin2,Wang Xiaoshuang1(1Department of Obstetrics,Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital,Chongqing 400021,China;2Department of Gynecology,The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China)AbstractObjective To explore the interventional effect of bilobalide(BB)on polycystic ovary syndrome(PCOS)model rats and the biological mechanism.Methods PCOS rat model was established by subcutaneous injection of 60 mg/kgd dehydroe-piandrosterone(DHEA)for 21 consecutive days.After modeling,rats were intraperitoneally injected with BB(50 mg/kg)every day for 3 weeks.The changes of Estrous cycle were detected by vaginal smear;ELISA kit was used to detect the levels of insulin,follicle stimulating hormone(FSH),luteinizing hormone(LH),estradiol(E2),progesterone(P4)in serum and TNF-,IL-1,IL-10 and IL-18 levels,and insulin resistance index was calculated;HE staining was used to observe the histopathology of the ovarian tissue,fluores-cence staining was used to detect the level of ROS in ovarian tissue,and immunohistochemical staining was used to detect the levels of SOCS3 and p-STAT3 in the ovarian tissue.Results In PCOS model rats,estrous cycle was irregular,ovarian histological structure was abnormal,serum levels of FSH,LH and P4 significantly increased,E2 levels significantly decreased;in ovarian tissue,in addition to a decrease in IL-10 levels,the levels of inflammatory factors such as TNF-,IL-1 increased;ROS obviously gathered in cystic follicles,fasting insulin increased,HOMA homeostasis model insulin resistance index increased,SOCS3 immunostaining significantly weakened,p-STAT3 immunostaining significantly increased.BB treatment significantly alleviated the above changes in PCOS model rats.Conclusion BB may exert therapeutic effects on PCOS rats by reducing estrogen,insulin,oxidative stress,and inflammatory lev-els,as well as inhibiting JAK/STAT3 signaling activity in the ovaries.KeywordsBilobalide;polycystic ovary syndrome;inflammation;oxidative stress;hormone regulation;insulin resistance;JAK/STAT3 signal多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄妇女中最见的内分泌疾病之一，约影响 5%10%的育龄妇女，其临床特征为无或稀发排卵、高雄激素和多囊卵巢综合征1,2。PCOS 除了能导致育龄妇女不孕外，受影响的妇女还可能出现各种继发疾病，如高雄激素症、心血管疾病和肥胖中国组织化学与细胞化学杂志262第 32 卷等3。尽管人们对 PCOS 确切的发病和进展机制仍不清楚，但目前已经了解其发病和进展与激素代谢异常、氧化应激以及胰岛素抵抗有关3,4。另外，近来的研究显示，PCOS 是一种长期慢性低度炎症状态，炎症被认为是 PCOS 发病和进展的一个潜在驱动因素，其炎性反应能加剧卵巢功能障碍、激素代谢异常和氧化应激5,6。因此，对 PCOS 的治疗策略的制定与管理也应从多方面综合考虑。白果内酯（bilobalide，BB）为传统中药材银杏叶的天然倍半萜三内酯化合物。现代药理学表明，其具有神经保护、抗氧化、抗炎、抗缺血、心血管保护与改善胰岛素抵抗等广泛的药理活性7。根据药理学推测，BB 可能在 PCOS 会发挥有益作用，但目前尚无这方面的研究。因此，我们建立 PCOS 大鼠模型给予 BB 干预，然后通过观察大鼠排卵周期变化、卵巢表现、血清激素水平、炎性、氧化应激等指标评估 BB 的作用。材料和方法1 材料1.1 实验动物40 只 SPF 级雌性 21 日龄 SD 大鼠（6070 g）购自重庆腾鑫生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（渝）2022-0005。动物被安置在温控（222）、湿控（555）%和 12h/12h 光照/黑暗周期的 SPF 级动物房中，可自由取水。1.2 实验试剂白果内酯（纯度 99%）和脱氢表雄酮（dehy-droepiandrosterone，DHEA；纯度99%）购自成都埃法生物科技有限公司；生物素标记的羊抗兔IgG、链霉亲和素-过氧化物酶结合物、DAB和SP法免疫组织化学试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；大鼠胰岛素、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、雌 二 醇（estradiol，E2）、孕 酮（progesterone，P4）、TNF-、IL-1、IL-10 和 IL-18 ELISA 检测试剂盒购自江苏酶免实业有限公司；冰冻切片活性氧（reactive oxygen species，ROS）荧光法试剂盒（氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，CMH2DCFDA）购自美国GENMED公司；细胞因子信号转导抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）、磷酸化的信号转导和转录激活因子 3（phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3）和GAPDH兔源单克隆抗体购自成都正能生物技术有限责任公司。2 方法2.1 实验动物分组与处理SD大鼠适应饲养2 d后，将其随机分为4组（每组 10 只）：对照组、BB 组、PCOS 组和 PCOS+BB组。将DHEA溶于芝麻油。按照文献方法8，9，PCOS组和 PCOS+BB 组大鼠连续 21 d 皮下注射 0.2 mL 溶于芝麻油的 DHEA（60 mg/kg）制作 PCOS 模型；其余组大鼠皮下注射等量（0.2 mL）芝麻油。之后，BB 组和 PCOS+BB 组的大鼠每天腹腔注射 BB（50 mg/(kg)，对照组和 PCOS 组大鼠给予同等体积的生理盐水，持续 21 d。按上诉方案处理结束后，每组任选 4 只大鼠在之后的 20 d 用阴道涂片法观察各组大鼠的动情周期。实验过程示意图如图 1A 所示。2.2 血清激素水平的测定治疗方案结束后，将大鼠禁食过夜，麻醉，收集心脏血液，用血糖仪（ACCU-CHEK Performa 型，德国 Roche 公司）检测空腹血糖水平，然后将血液以3000 r/min 离心10 min，收集血清。按照各自对应的ELISA 试剂盒说明书步骤进行 ELISA 反应，并根据预制的工作曲线计算出血清中的胰岛素、FSH、LH、E2 和 P4 水平。用 HOMA 稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）来评估胰岛素抵抗水平。HOMA-IR 的计算公式为：HOMA-IR=空腹葡萄糖（mmol/L）空腹胰岛素（mIU/L）/22.5。2.3 卵巢组织中炎症因子水平的测定治疗方案结束后，大鼠麻醉后，收集双侧卵巢组织，将左侧卵巢组织用于后续 ROS 检测和免疫组织化学染色，右侧卵巢组织冷冻于-80用于后续实验。取冷冻的右卵巢组织，待复温后，加入 9 倍组织重量的冷生理盐水，冰上匀浆，将匀浆液以3000 r/min离心10 min，收集上清液。按照各自对应的 ELISA 试剂盒说明书步骤进行 ELISA 反应，并根据预制的工作曲线计算出上清液中的 TNF-、IL-1、IL-10 和 IL-18 水平。同时，用 BCA 法检测出上清液中的蛋白浓度。根据蛋白浓度将上清液中的TNF-、IL-1、IL-10和IL-18 水平换算成单位 mg 蛋白中的上述炎症因子的水平。刘雨等.白果内酯对多囊卵巢综合征大鼠模型的干预作用第 3 期 2632.4 卵巢组织中 ROS 水平的测定取新鲜的左侧卵巢组织浸入OCT包埋剂中固形并浸入液氮中 20 s，用冰冻切片机切成 10 m 厚度的切片。按照试剂盒实验步骤，加 500 L 上清理液A 清洗切片 1 次，加上 200 L 染色工作液（1100稀释）37 避光孵育 20 min，再用 500 L 上清理液 A 清洗 1 次切片，用 DAPI 染核，荧光显微镜下观察。2.5 组织病理学检测取左侧卵巢组织，并用石蜡包埋，然后用石蜡切片机将其切为 6 m 厚度的切片。将切片脱蜡至水后，用 HE 染色，并用苏木素复染，光学显微镜下观察卵巢组织形态、黄体和卵泡情况。2.6 免疫组织化学染色根据试剂盒说明书步骤，将镶嵌卵巢组织的石蜡切片（6 m 厚度）依次脱蜡至水、灭活内源性酶和热抗原修复后，用 10%山羊血清封闭 30 min，分别滴加兔抗SOCS3抗体（1250）和兔抗p-STAT3抗体（1100）37 下孵育 2 h，PBS 清洗 5 次，滴加生物素标记的羊抗兔 IgG（1100）37 下孵育 30 min，PBS 清洗 5 次，滴加链霉亲和素-过氧化物酶结合物（1100）37 下孵育 30 min，PBS 清洗 5次，DAB 显色后苏木素复染，光学显微镜下观察。2.7 统计学方法数据以均数 标准差表示。用 GraphPad Prism 9.0 版软件对数据行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，并用Bonferroni法对各组均数进行两两比较。当 P0.05 时则认为差异具备统计学意义。结 果1 白果内酯改善多囊卵巢综合征大鼠卵巢功能在治疗结束后连续 20 d 内观察动情周期变化发图 1 白果内酯对多囊卵巢综合征大鼠动情周期与卵巢组织病理学的影响。A，实验设计示意图，S.C，皮下注射，i.p.,腹腔注射。B，大鼠发情间期/后期（M/D）时相比例的统计分析；n=4；C，卵巢组织病理学代表性 HE 染色检测；比例尺，1 mm。DF，黄体（D）、囊状滤泡（E）和闭锁卵泡数（F）的统计分析；与 Con 组相比，*P0.05；与 PCOS 组相比，#P0.05；n=6Fig 1 The effect of bilobalide on the estrous cycle and ovarian histopathology of the rats with polycystic ovary syndrome.A,schematic illustration of the experimental design;s.c.,subcutaneous injection;i.g.,intragastric administration.B,quantitative analysis of the percentages of metestrus/diestrus phase(M/D)phase of the rats(n=4).C,representative HE staining examination of ovary histopathology;scale bar,1 mm.D to F,quantitative analysis of the number of the corpus luteum(D),cystic follicle(E)and atretic follicle(F);*P0.05,compared with Con;#P0.05,compared with PCOS;n=6中国组织化学与细胞化学杂志264第 32 卷现（图 1B），对照组和 BB 组大鼠表现为正常规则的动情周期（约 45 个动情周期）；PCOS 组大鼠多数处于动情间期/后期（M/D 期），处于 M/D 期总时间占比较对照组明显增高；PCOS+BB 组大鼠的动情周期紊乱得到改善，处于 M/D 期总时间占比较 PCOS 组明显降低。HE 染色检测卵巢病理表现显示，对照组和BB组大鼠的卵巢结构正常，可见生长卵泡和黄体；PCOS组大鼠的卵巢呈多囊结构可见囊状滤泡，有闭锁的卵泡，黄体减少；与 PCOS 组比较，PCOS+BB 组大鼠的卵巢组织形态趋向正常，囊状滤泡和闭锁的卵泡变少，黄体增多（图 1C-1F）。2 白果内酯改善多囊卵巢综合征大鼠血清激素紊乱ELISA 检测显示，与对照组比较，PCOS 组大鼠血清中 FSH、LH 和 P4 水平明显增高，E2 水平明显降低；与 PCOS 组比较，PCOS+BB 组大鼠血清中 FSH、LH 和 P4 水平明显降低，E2 水平明显升高（图 2）。结果提示 BB 对 PCOS 激素分泌异常有改善作用。3 白果内酯改善多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织炎症和氧化应激水平PCOS 中的低度慢性炎症和氧化应激是 PCOS与卵巢功能障碍、代谢异常和心血管疾病之间的潜在联系之一；BB 具有抗炎和抗氧化的药理活性。对 BB是否能调节卵巢组织的炎症细胞因子水平的分析显示，与对照组相比，PCOS组卵巢中的TNF-、IL-1和IL-18的水平都有所增加，IL-10水平下降，而应用图 2 白果内酯对多囊卵巢综合征大鼠血清激素水平影响的统计学分析。A,FSH；B，LH；C，P4；D，E2；与 Con 组相比，*P0.05；与 PCOS 组相比，#P0.05Fig 2 Statistical analysis of the effect of bilobalide on the serum hormone levels in the rats with polycystic ovary syndrome.A,FSH;B,LH;C,P4;D,E2;*P0.05,com-pared with Con;#P0.05,compared with PCOS;n=6图3 白果内酯对多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织中炎症因子水平影响的 ELISA 分析。A，TNF-；B，IL-1；C，IL-10；D，IL-18；与 Con 组相比，*P0.05；与PCOS 组相比，#P0.05；n=6Fig 3.ELISA examination of the effect of bilobalide on the levels of inflammatory factors in ovarian tissue of the rats with polycystic ovary syndrome.A,TNF-;B,IL-1;C,IL-10;D,IL-18;*P0.05,compared with Con;#P0.05,compared with PCOS;n=6刘雨等.白果内酯对多囊卵巢综合征大鼠模型的干预作用第 3 期 265BB治疗后显著降低PCOS大鼠血清中的TNF-、IL-1 和 IL-18 的水平，并增加 IL-10 的水平（图 3）。对卵巢组织中 ROS 水平检测显示，对照组和 BB 组大鼠卵巢中未见明显的ROS标记物阳性荧光显色，ROS 在 PCOS 组大鼠卵巢的囊性卵泡中明显集聚，应用 BB 治疗后的 ROS 水平明显降低（图 4）。图 4 白果内酯对多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织中 ROS 水平影响的荧光染色检测。比例尺，250 mFig.4 Examination by fluorescence staining of the effect of bilobalide on the ROS levels in the ovarian tissue of the rats with polycystic ovary syn-drome.Scale bar,250 m4 白果内酯降低多囊卵巢综合征大鼠胰岛素水平升高和胰岛素抵抗胰岛素抵抗/高胰岛素血症是 PCOS 患者代谢异常的基本特征。ELISA分析显示，PCOS大鼠的空腹胰岛素和 HOMA-IR 显著高于对照组；BB 治疗可显著抑制PCOS 大鼠的空腹胰岛素水平和 HOMA-IR值（图 5）。5 白果内酯抑制多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织SOCS3 水平下降和 p-STAT3 水平升高对卵巢组织切片进行免疫组织化学染色检测显示：与对照组相比，PCOS 组的 SOCS3 的免疫染色显著下降，而 p-STAT3 的免疫染色显著增加；而在BB 治疗的 PCOS 大鼠中，SOCS3 水平的下降和 p-STAT3 水平升高被显著抑制（图 6）。讨 论PCOS是一种极其复杂的内分泌和代谢疾病1,2。虽然在很多方面对该病的认识已取得了进步，但其病因和进展机制尚未完全阐明，治疗手段也未取得突破性进展。目前，PCOS 的临床治疗主要是药物和手术相结合，药物治疗 PCOS虽然可以改善临床症状，但也存在很多不足，如诱发子宫内膜变薄、增加血栓形成的风险、损害乙肝患者的肝功能等10。手术治疗主要包括腹中国组织化学与细胞化学杂志266第 32 卷腔镜下卵巢穿孔术和卵巢楔形切除术11，但其最大的副作用是对卵巢的破坏和储备卵泡的消耗，导致很多患者卵巢早衰12。临床研究表明，中医药治疗本病具有天然低毒甚至无毒、疗效持久、疗效全面、患者依从性强等优点，越来越受到人们的欢迎13。因此，近年来，越来越多的研究人员将目光转向了传统的中医药。现代药理学表明，BB 具有抗炎、抗氧化、镇痛、增强免疫、调节激素分泌和改善胰岛素抵抗等多重药理作用6,7，按照药理学推测其可能在 PCOS 中发挥有益作用。在本研究中，我们发现 BB可以显著升高 PCOS大鼠血清图 5 白果内酯对多囊卵巢综合征大鼠空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗影响的统计学分析。A，血清中空腹胰岛素的浓度；B，HOMA-IR 值；与 Con 组相比，*P0.05；与 PCOS 组相比，#P0.05；n=6Fig.5 Statistical analysis of the effect of bilobalide on fasting insulin level and insulin resistance in the rats with polycystic ovary syndrome.A,fasting insulin concentrations in serum;B,HOMA-IR value;*P0.05,compared with Con;#P0.05,compared with PCOS;n=6图 6 白果内酯对多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织中 SOCS3 和 p-STAT3 水平影响的免疫组织化学检测。A，SOCS3（上）和 p-STAT3（下）水平的代表性免疫组织化学检测；比例尺，50 m。B，SOCS3（左）和 p-STAT3（右）水平的统计学分析；与 Con 组相比，*P0.05；与 PCOS组相比，#P0.05；n=6Fig 6 Immunohistochemical examination of the effect of bilobalide on the levels of SOCS3 and p-STAT3 in the ovarian tissues of the rats with poly-cystic ovary syndrome.A,representative immunohistochemical examination of levels of SOCS3(upper)and p-STAT3(lower);scale bar,250 m.B,quantitative analysis of the levels of SOCS3(left)and p-STAT3(right);*P0.05,compared with Con;#P0.05,compared with PCOS;n=6刘雨等.白果内酯对多囊卵巢综合征大鼠模型的干预作用第 3 期 267激素水平，降低卵巢中炎性和氧化反应，并有效改善胰岛素抵抗，这些结果表明，BB可能是 PCOS 潜在的治疗剂。Li 等14和 Wang 等15研究发现 JAK/STAT3 信号激活能抑制PCOS中的卵泡发育与颗粒细胞增殖。另外，PCOS的发生与进展和胰岛素抵抗、低度炎症和氧化应激有关3-6。JAK/STAT3信号已被发现是参与调节胰岛素抵抗、炎症反映和氧化应激的所有信号通路的交汇信号转导通路16。并且，已有研究证明抑制 JAK/STAT3 信号可减轻 PCOS 大鼠的胰岛素抵抗、降低卵巢内炎性反应与氧化应激17-19。本研究证明了 p-STAT3 水平在 PCOS 大鼠卵巢中表达上调，但其可被 BB 处理所抑制。此外，我们还验证了SOCS3（JAK/STAT3 信号通路的主要负调节因子）在 PCOS 大鼠卵巢中被急剧抑制，但在 BB 的治疗下被部分逆转，并进一步证明了 BB 对 PCOS 的治疗作用可能与抑制 JAK/STAT3 信号有关。综上，我们的数据显示，BB可以改善PCOS大鼠卵巢组织形态与功能、激素分泌紊乱和胰岛素抵抗，并降低卵巢内炎症反应与氧化应激以及 JAK/STAT3信号活化。所有这些结果表明，BB可能对治疗PCOS有一定的效果。参 考 文 献1 Sadeghi HM,Adeli I,Calina D,et al.Polycystic ovary 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