白细胞介素-6基因-572G-C与-634G-C多态位点系同一位点.doc

白细胞介素-6基因-572G/C与-634G/C多态位点系同一位点的分析
摘 要 近来研究发现，运动可以诱导骨骼肌大量表达白细胞介素-6（il-6），并在能量代谢过程中发挥着重要作用。il-6基因多态性可影响其蛋白的表达和生物功能的发挥，因而il-6基因多态性成为代谢性疾病的遗传筛查、运动员遗传选材等关注的焦点。有研究分别分析了-572c/g、-634c/g位点多态性，也有研究同时分析这两个位点的多态性，但其研究中显示等位基因、基因型分布频率极为相似，那么这两个位点是否是高度连锁的不同位点？还是这两个位点其实就是同一位点？本研究运用pcr-rflp、基因测序及序列比对（blast），从不同角度对-572c/g、-634c/g位点是否是同一位点进行分析。
关键词 il-6 基因多态性 -572c/g -634c/g 同一位点
中图分类号：r392.13 文献标识码：a
interleukin-6 gene polymorphism of -572g/c and
-634g/c point to the same site analysis

chen junfei
(jiangsu institute of sports science, nanjing, jiangsu 210033)
abstract recent study has found that exercise can induce large amounts of il- -6 expression in skeletal muscle (il-6), and played an important role in the energy metabolism processes. il-6 gene polymorphism may affect its expression and biological function of proteins and il-6 gene polymorphism of metabolic diseases of genetic screening, genetic selection of athletes and other focus of attention. study analysis, respectively -572c/g, -634c/g locus polymorphism, there are research and analysis of polymorphism of both sites, but their research shows the allele, genotype frequency distribution very similar, this is a high point two chains of different sites? are these two points is the same point? this study using pcr-rflp, genes, sequencing and sequence alignments (blast), from a different perspective, and analysis on-572c/g and -634c/g point at the same point.
key words il-6; gene polymorphisms; -572c/g; -634c/g; at the same point
0 前言
众所周知，体育锻炼可以提高机体的免疫力，那么其究竟如何改善机体的免疫能力呢？研究者进行了运动与免疫方面的研究，结果显示il-6对运动的反应是最明显的。进一步研究发现，运动能够诱导骨骼肌表达il-6，并参与能量代谢，il-6不仅可以增加骨骼肌对葡萄糖摄取和利用，而且能增加脂肪酸氧化。
在医学中，研究人员在密切关注il-6与代谢性疾病的遗传、发生、发展的相关关系；与体育科学中，il-6也被用于遗传选材的研究等。随着对il-6越来越多的关注和研究的深入，关于il-6基因多态性的文献也越来越丰富。其中，有研究分别分析了-572c/g、-634c/g位点多态性，也有研究同时分析这两个位点的多态性，但其研究中显示等位基因、基因型分布频率极为相似，那么这两个位点是否是高度连锁的不同位点？还是这两个位点其实就是同一位点？本研究试图运用多种方法系统、准确论证il-6基因-572c/g、-634c/g位点是否是同一位点进行分析。
1 研究对象与方法
1.1 研究对象
研究对象来自北京市城区某中学（12~15岁）142名学生，其中男生63人，女生79人，父母均为北方平原汉族。
1.2 研究方法
1.2.1 -634c/g、 -572c/g位点引物序列比对
分别对文献中所引用的-572c/g、-634c/g位点引物在ucsc上的(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgblat?org=human) 进行blast，鉴别pcr产物是否是il-6基因的扩增产物。
1.2.2聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（pcr-rflp）法基因分型
所有受试者空腹抽取静脉血，采用胍盐酸法提取基因组dna，pcr-rflp法对多态位点等位基因进行基因型分型。 -572c/g、-634c/g引物分别采用文献中的引物，引物由北京赛百成盛有限公司合成。引物序列如下：
分别进行基因序列扩增，-634c/g 位点：pcr反应体系20 l，包括0.4 l基因组dna，10?譖cr buffer 2 l，taqdna 聚合酶1u，2.5mmol/l dntps 0.6 l，10 m上下游引物各1 l，ddh2o 14.5 l。pcr反应循环参数：94℃预变性反应4min ；94℃变性 30s，58℃退火 30s，72 ℃延伸 30s，30 个循环；72℃延伸10min，4℃保存。-572c/g 位点：pcr反应体系20 l，包括0.3 l基因组dna，10?譖cr buffer 2 l，taqdna 聚合酶1u， 2.5mmol/l dntps 0.6 l，10 m上下游引物各1 l，ddh2o 15.5 l。pcr反应循环参数：94℃预变性反应4min ；94℃变性 30s，57℃退火 30s，72 ℃延伸 30s，30 个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
扩增产物均用mbii限制性内切酶进行酶切，反应终产物进行跑胶，在紫外灯下判断多态位点基因型。il-6 基因-634c/ g多态性，pcr 扩增产物片段大小为181 bp，根据限制性内切酶mbii 酶切片段的情况，基因型有3 种，cc 型(181bp 1 条带)，cg型(181bp，121bp，60bp 3 条带)，gg型(121bp，60bp 2 条带)。il-6 基因-572c/ g多态性，pcr 扩增产物片段大小为182 bp，根据限制性内切酶mbii 酶切片段的情况，基因型有3 种，cc 型(182bp 1 条带)，cg型(182bp，122bp，60bp 3 条带)，gg型(122bp，60bp 2 条带)。

1.2.3 pcr产物基因测序
随机抽取不同基因型受试者的pcr产物6份（每种基因型2份），对rs1800796位点的部分pcr产物用abi prism 3730xl测序仪进行序列测定，测序试剂为bigdye terminator v3.1。测序结果经chromas软件对待检位点分析碱基类型。基因测序工作由上海生工生物工程有限公司(sangon)完成。
1.3 统计分析
统计学处理采用spss 11.5（spss software for windows 11.5 package）统计软件包进行数据统计分析。多态位点的基因型分布情况进行hardy-weinberg平衡检验，检验样本是否来自同一群体。不同组间多态位点的分布频率的差异采用卡方检验。
2 研究结果
2.1 引物比对结果
在ucsc上 (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgblat?org=human)分别对引物进行blast，结果显示产物是il-6基因的扩增产物。
2.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（pcr-rflp）法基因分型结果
图1 不同基因型pcr片段测序结果
il-6基因-572c/g、-634c/g位点等位基因分布一致：c（197），g（101），且基因型分布频率一致：cc（66人），cg（67人），gg（14人），均符合hardy-weinberg平衡检验（ 2 = 0.507，p = 0.476），样本均来源于同一群体。
2.3 pcr产物基因测序结果
pcr产物测序结果显示：同一受试者基因型一致，且两个产物序列一致。基因测序图如图1所示。
3 分析与讨论
3.1 引物比对结果分析
对文献[5]中il-6基因 -634c/g位点和-572c/g位点引物blast结果显示产物是il-6基因的扩增产物。这与引物引自il-6基因多态研究文献是一致的。
3.2 等位基因分布及基因型分布频率分析
文献中对于这两个位点同时的分析，也是发现其等位基因分布、基因分布频率相似。本研究结果显示il-6基因-572c/g、-634c/g位点等位基因分布一致：c（197），g（101），且基因型分布频率一致：cc（66人），cg（67人），gg（14人），均符合hardy-weinberg平衡检验（ 2 = 0.507，p = 0.476），样本均来源于同一群体。因此，-572c/g与-634c/g位点极可能是高度连锁的两个多态位点，或者这两个位点其实是同一位点。故有必要对pcr产物的序列进行测序，研究两个位点是否在同一位置。
3.3 位点一致性分析
所有-634c/g位点的研究文献中所用的引物，均是引用前人，追其源头，实际上是来源于1999年发表的文献，而人类基因组草图于2001年初在《自然》和《科学》杂志上公布，公布时草图还有许多缺陷，一些定位并不准确，随后科学家后续的序列测定和检验，使基因图精度不断提高，达到99.9%以上。并且从最新的dpsnp数据库中il-6基因并没有-634c/g snp位点。
本研究对不同基因型pcr产物进行基因序列测定，并将产物序列在ncbi上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/blastgen/blastgen.cgi ?taxid=9606)进行序列比对，结果显示两个产物序列一致，多态位点的位置相同，且同一受试者基因型一致，这两个多态位点是同一个位点，即rs1800796多态位点。
因而，在我们今后的研究和分析中，就可以把以前关于-634c/g位点和-572c/g位点的研究成果放在一起共同讨论。这将极大丰富、并综合以往关于il-6基因多态性研究的成果。
3.4 位点表述的准确性分析
由于该位点位于il-6基因转录起始点上游-572位，故-634c/g的描述并不准确，准确的表述是-572c/g。
4 结论
（1）文献中所述的il-6基因-634c/g位点与大多文献所述的-572c/g位点是同一位点，即rs1800796。
（2）关于il-6基因-634c/g位点和-572c/g位点研究文献中的研究结果可以放在一起共同讨论。
参考文献
[1] pedersen bk, toft ad. effects of exercise on lymphocytes and cytokines. br j sports med. 2000. 34(4): 246-51.
[2] nielsen ar, pedersen bk. the biological roles of exercise-induced cytokines: il-6, il-8, and il-15. appl physiol nutr metab. 2007. 32(5): 833-9.
[3] 韦叶生,李壮,覃羽华.白细胞介素- 6 基因启动子多态性与血脂及血小板计数关系的研究.中国医师杂志,2005.7(5):583.
[4] kim jg, ku sy, lim ks, et al. cytokine production by whole blood cells: relationship to interleukin gene polymorphism and bone mass. j korean med sci. 2005. 20(6): 1017-22.
[5] jang y, kim oy, hyun yj, et al. interleukin-6-572c>g polymorphism-association with inflammatory variables in korean men with coronary artery disease. transl res. 2008. 151(3): 154-61.