补阳还五汤通过调控PI3K_Akt、JAK2_STAT3信号促进BMSC趋化迁移对外伤性脊髓损伤大鼠神经元活性及认知功能的影响.pdf

rat models with osteoporosis也J页.Cell Mol Biol(Noisy鄄le鄄grand),2022;68(8):163鄄6郾16摇 Yu L,Li H,Hou S,et al郾 Abnormal bone mineral density and boneturnover marker expression profiles in patients with primary sponta鄄neous pneumothorax也J页.J Thorac Dis,2016;8(6):1188鄄96郾17摇 Atsumi Y,Rino Y,Wada H,et al郾 Changes in bone metabolism aftergastric cancer surgery in male patients:a prospective observationalstudy也J页.Gastric Cancer,2019;22(1):237鄄43郾18摇 Chartron E,Firmin N,Touraine C,et al郾 A phase 域 multicenter trialon high鄄dose vitamin D supplementation for the correction of vitaminD insufficiency in patients with breast cancer receiving adjuvantchemotherapy也J页.Nutrients,2021;13(12):4429郾19摇 Wang XJ,Bai X,Miu Y,et al郾 The assessment value of pathologicalcondition of serum adiponectin and amylin in primary osteoporosisand its correlation analysis with bone metabolism indexes也J页.J MedBiochem,2023;42(1):86鄄93郾20摇 Chen L,Wu J,Ren W,et al郾 Association of osteoporosis and skeletalmuscle loss with serum type 玉 collagen carboxyl鄄terminal peptide 茁glypeptide:a cross鄄sectional study in elder Chinese population也J页.Open Med(Wars),2023;18(1):20230642郾21摇 Sun LL,Cao RR,Wang JD,et al郾 Establishment of reference intervalsfor bone turnover markers in healthy chinese older adults也J页.AnnHum Biol,2023;50(1):172鄄86郾也2023鄄03鄄19 修回页(编辑摇 滕欣航)基础研究补阳还五汤通过调控 PI3K/Akt、JAK2/STAT3 信号促进 BMSC 趋化迁移对外伤性脊髓损伤大鼠神经元活性及认知功能的影响宋颖军摇 李旭摇 刘小舟摇 张国福摇(江西中医药大学附属医院,江西摇 南昌摇 330006)摇 摇 也摘摇 要页摇 目的摇 研究补阳还五汤通过调控磷脂酰肌醇鄄3 激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)、内源性酪氨酸激酶(JAK)2/信号传导和转录启动因子(STAT)3 信号促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)趋化迁移对外伤性脊髓损伤大鼠的神经元活性及认知功能的影响。方法摇 选取健康大鼠 53 只,随机分为健康组(健康大鼠常规饲养)、损伤组(建立脊髓损伤模型)、干预组(补阳还五汤治疗)、对照组(甲泼尼龙治疗),每组 12 只,剩余 5 只大鼠用于补阳还五汤含药血清制备。流式细胞术鉴定 BMSCs 细胞。Transwell 小室法测大鼠 BMSCs 迁移。高架十字迷宫和 Morris 水迷宫实验检测大鼠认知功能。苏木素鄄伊红(HE)染色检测脊髓组织病理形态。TUNEL 测脊髓组织神经细胞凋亡。免疫组化检测 p鄄JAK2、p鄄STAT3。Western 印迹测 PI3K、p鄄PI3K、Akt、p鄄Akt。结果摇 传代后的培养细胞呈旋窝状或放射状贴壁生长,细胞多呈星形、梭形或三角状,培养 3 代后,细胞贴壁加快、形态均一,呈旋窝状或单层放射状生长。培养细胞表面抗原 CD29、CD90 为阳性,CD31、CD45 为阴性,提示其为 BMSCs 细胞。与健康组相比,损伤组总路程、进入开臂次数、穿越平台次数显著降低,不同时间的潜伏期显著升高(P0郾 05)。与损伤组相比,干预组与对照组总路程、进入开臂次数、穿越平台次数显著升高,不同时间的潜伏期显著降低(P0郾 05)。健康组脊髓组织结构完整。损伤组脊髓组织疏松水肿,有细胞空泡变性产生。相较于损伤组,干预组与对照组大鼠脊髓组织病理形态有所改善。与健康组相比,损伤组 BMSCs、PI3K、Akt、p鄄PI3K、p鄄Akt 显著降低,神经细胞凋亡率、p鄄JAK2、p鄄STAT3 显著升高(P0郾 05)。与损伤组相比,干预组 BMSCs、PI3K、Akt、p鄄PI3K、p鄄Akt 显著升高,神经细胞凋亡率、p鄄JAK2、p鄄STAT3 显著降低(P0郾 05)。结论摇补阳还五汤通过激活 PI3K/Akt 通路抑制 JAK2/STAT3 信号通路的激活,促进 BMSCs 的迁移,减轻神经细胞的凋亡,起到神经保护的作用,从而改善脊髓损伤大鼠的认知功能。也关键词页摇 补阳还五汤;磷脂酰肌醇鄄3 激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt);内源性酪氨酸激酶(JAK)2/信号传导和转录启动因子(STAT)3;骨髓间充质干细胞(BMSCs)趋化迁移;神经元活性;认知功能也中图分类号页摇 R651郾 21摇 也文献标识码页摇 A摇 也文章编号页摇 1005鄄9202(2023)17鄄4206鄄08;doi:10郾 3969/j郾 issn郾 1005鄄9202郾 2023郾 17郾 033基金项目:国家自然科学基金项目(81860856)通信作者:张国福(1968鄄),男,博士,主任医师,主要从事创伤、脊髓损伤等研究。第一作者:宋颖军(1979鄄),男,硕士,副主任医师,主要从事开放性骨折及骨折不愈合、神经损伤研究。Buyang Huanwu Decoction promotes chemotaxis and migration of BMSC byregulating PI3K/Akt and JAK2/STAT3 signals and the effect on neuronalactivity and cognitive function in rats with traumatic spinal cord injurySONG Ying鄄Jun,LI Xu,LIU Xiao鄄Zhou,et al郾6024中国老年学杂志 2023 年 9 月第 43 卷Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine,Nanchang 330006,Jiangxi,China揖Abstract铱摇 Objective摇 To study the effect of Buyang Huanwu Decoction on the neuronal activity and cognitive function of ratswith traumatic spinal cord injury by regulating phosphatidyl inositol 3 kinase/protein kinase B(PI3K/AKT)and endogenous tyrosine ki鄄nase(JAK)2/signal transduction and activator of transcription(STAT)3 signals to promote the chemotaxis and migration of bone marrowmesenchymal stem cells(BMSCs).Methods摇 Fifty鄄three healthy rats were selected and randomly divided into healthy group(conven鄄tional feeding of healthy rats),injury group(establishing a spinal cord injury model),intervention group(treatment with Buyang Hua鄄nwu Decoction)and control group(methylprednisone treatment),with 12 rats in each group,and the remaining 5 rats were used forthe preparation of Buyang Huanwu Decoction鄄containing serum.BMSCs were identified by flow cytometry.Transwell cell method wasused to measure the migration of rat BMSCs.The elevated plus maze and Morris water maze experiments were used to detect the cogni鄄tive function of rats.Pathological morphology of spinal cord tissue was detected by hematoxylin鄄eosin(HE)staining.TUNEL was used tomeasure the apoptosis of nerve cells in spinal cord tissue.Immunohistochemical was used to detect p鄄JAK2 and p鄄STAT3.PI3K,p鄄PI3K,Akt and p鄄Akt were measured by Western blotting.Results摇 After passage,the cultured cells grew in a spiral or radial shape.The cells were mostly star鄄shaped,spindle鄄shaped or triangular.After 3 generations,the cells adhered to the wall faster and had uni鄄form morphology,showing a spiral or single鄄layer radial shape grow.The cultured cell surface antigens CD29 and CD90 were positive,and CD31 and CD45 were negative,indicating that they were BMSCs cells.Compared with the healthy group,the total distance,thenumber of times to enter the open arms,the number of times to cross the platform were significantly reduced,and the incubation periodof different time were significantly increased in injury group(P0.05).Compared with the injury group,the total distance,the numberof times to enter the open arms,the number of times cross the platform were significantly increased,and the incubation period of differ鄄ent time were significantly decreased in the intervention group and the control group(P0.05).The structure of the spinal cord in the healthy group was complete.In the injury group,the spinal cord tissue was loose and swollen,and there was degeneration of cell vacuoles.Compared with the injurygroup,the pathological morphology of the spinal cord tissue of the intervention group and the control group were improved.Comparedwith the healthy group,BMSCs,PI3K,AKT,p鄄PI3K and p鄄Akt were significantly decreased and the apoptosis rate of nerve cells,p鄄JAK2 and p鄄STAT3 were significantly increased in the injured group(P0.05).Compared with the injury group,BMSCs,PIK,Akt,p鄄PI3K,and p鄄AKT were significantly increased,and the apoptosis rate of nerve cells,p鄄JAK2 and p鄄STAT3 were significantly de鄄creased in the intervention group(P0.05).Conclusions摇 Buyang Huanwu Decoction could inhibit the activation of JAK2/STAT3 signaling pathway byactivating PI3K/Akt pathway,promote the migration of BMSCs,reduce nerve cell apoptosis,play a neuroprotective effect,and improvethe cognition of rats with spinal cord injury features.揖Key words铱摇 Buyang Huanwu Decoction;Phosphatidyl inositol 3 kinase/protein kinase B(PI3K/Akt);Endogenous tyrosinekinase(JAK)2/signal transduction and activator of transcription(STAT)3;Chemotaxis and migration of bonemarrow mesenchymal stem cells(BMSCs);Neuronal activity;Cognitive function摇 摇 外伤脊髓损伤是中枢神经系统的严重损伤,多发生于交通事故、坠落等,是发病率及致残率较高的一种疾病。脊髓损伤后,脊髓内部岀血、水肿,出现神经元凋亡、坏死等现象,进而导致神经系统功能破坏也1,2页。目前认为,神经细胞凋亡是脊髓损伤后神经功能障碍的主要原因,磷脂酰肌醇鄄3 激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)具有调控细胞增殖及凋亡的作用。研究表明也3页PI3K、磷酸化(p鄄)Akt 在脊髓损伤发展过程中表达升高,与脊髓损伤机体脊髓细胞凋亡有关。基因调控的启动需要复杂而周密的信号转导系统,内源性酪氨酸激酶(JAK)/信号传导和转录启动因子(STAT)通路是近年来备受关注的一条通路,具有调节细胞生物学行为及免疫功能的作用。研究表明也4页,脊髓损伤后可异常激活该通路,从而导致神经细胞凋亡。补阳还五汤是中国清代著名医家王清任所创立的经典方剂,该方由黄芪、赤芍、当归、地龙、川芎、桃仁和红花药物组成。已有报道证实也5页该方剂在促进损伤神经再生修复等方面有其独特的效果。本文探讨补阳还五汤通过调控 PI3K/Akt、JAK2/STAT3 信号促进骨髓间充质干细胞(BM鄄SCs)趋化迁移对外伤性脊髓损伤大鼠的神经元活性及认知功能的影响。1摇 材料和方法1郾 1摇 实验动物与分组摇选取健康大鼠 53 只,购自北京亿鸣复兴公司提供也生产许可证号:SCXK(京)鄄2019鄄0034页。大鼠体质量 220 300 g,常规饲养,自由饮食饮水。随机分为健康组(健康大鼠常规饲7024宋颖军等摇补阳还五汤通过调控 PI3K/Akt、JAK2/STAT3 信号促进 BMSC 骨髓干细胞趋化迁移对外伤性脊髓损伤大鼠的神经元活性及认知功能的影响摇 第 17 期养)、损伤组(建立脊髓损伤模型)、干预组(脊髓损伤模型+补阳还五汤)、对照组(脊髓损伤模型+甲泼尼龙),每组12 只,剩余5 只大鼠用于补阳还五汤含药血清制备。本研究经医院动物伦理委员会批准。1郾 2摇实验试剂摇结晶紫溶液(南京生航公司);PI3K、p鄄PI3K、Akt、p鄄Akt 一抗(广州柏赛柯公司);辣根过氧化物酶二抗(西安齐岳公司);伊红染色液(北京金克隆公司);TUNEL 反应液(苏州优逸兰迪公司);苏木素染色液(大连芮禹公司);RIPA 裂解液(武汉卡诺斯公司)。1郾 3摇 药物制备摇补阳还五汤由医院制剂室加工,1 ml汤药含生药4 g,即4 g/ml 质量浓度,无菌封瓶,-20 益冰箱保存备用。甲泼尼龙购自广州贝尔卡公司。1郾 4摇 模型建立及给药摇 健康组大鼠无处理,其余各组大鼠戊巴比妥钠麻醉,俯卧位固定在 T8 棘突中心作长约 3 cm 切口暴露硬脊膜,采用 Allen 装置以20 g伊25 mm损伤力度行重物打击法制作大鼠外伤性脊髓损伤模型。模型制备成功判定标准:脊髓打击后,损伤处脊髓出血、水肿,大鼠出现摆尾反射,双下肢及躯体回缩样扑动,麻醉清醒后双下肢成弛缓性瘫痪也6页。建模成功后损伤组无处理,干预组给予制备好的补阳还五汤 1 ml 灌胃,1 次/d,28 d也7页,对照组经腹腔注射给予甲泼尼龙30 mg/kg,1 次/d,28 d。1郾 5摇BMSCs 分离养鉴定摇根据文献也8页大鼠原代BMSCs 提取方法,戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,于75%酒精中浸泡消毒 5 10 min。使用眼科剪将10 只转 T 克隆绿色荧光蛋白(GFP)基因的大鼠双侧股骨及胫骨取出,浸泡于预冷的培养基,使用10 ml注 射 器 冲 洗 骨 髓 腔 直 至 股 骨 胫 骨 变 白,1 000 r/min离心 5 min。使用含有 10%胎牛血清和1%双抗体(青霉素鄄链霉素)完全培养基重悬浮,置于 T12 的培养瓶中培养 24 h 后更换培养基。之后每隔 2 d 更换培养基。当细胞融合率达到 70%80%时进行细胞传代。光镜下检测细胞形态。1郾 6摇 脊髓组织提取摇取各组大鼠,麻醉后处死,从背部原切口进入,切取 2 cm 损伤部位及其上下段脊髓组织,置于 EP 管中,-70 益备用。1郾 7摇 补阳还五汤含药血清的制备摇取 5 只大鼠给予补阳还五汤 3 ml 灌胃,2 次/d,共 1 w,末次灌胃1 h后腹主动脉取血,离心后取上清,置于-20 益保存也9页。1郾 8摇 检测指标1郾 8郾 1摇 流式细胞术鉴定 BMSCs 细胞摇 取第三代细胞通过流式细胞术鉴定细胞表面标记 CD29、CD90、CD45 和 CD31 以检测细胞纯度。纯度评估后,使用第三代的细胞以 1伊105/ml 密度在成骨和成脂专用培养基中进行 BMSCs 定向成骨细胞、成脂、成神经细胞分化诱导培养。1郾 8郾 2摇Transwell 小室法检测补阳还五汤对大鼠BMSCs 迁移的影响摇取 BMSCs 放入完全培养基内培养,于12 h 观察 BMSCs 迁移情况。取第三代 BM鄄SCs,分为空白组(常规培养),含药血清组(加入2郾 6 g/ml补阳还五汤含药血清也9页),药物对照组(加入 10-7mol/L 甲泼尼龙也10页),培养 24 h 后,调整细胞密度为 5伊104/孔,100 滋l 接种于 Transwell 上室;下室加入完全培养基 600 滋l,37 益培养12 h 后取出Transwell,吸掉上下室培养液,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗 3 遍,4%多聚甲醛固定 30 min。晾干,擦去上层未迁移细胞。结晶紫染色20 min。使用光学显微镜进行观察,随机选择 5 个视野进行细胞计数。重复 3 次,每次 3 个复孔。1郾 8郾 3摇高架十字迷宫和 Morris 水迷宫实验检测大鼠认知功能摇脊髓损伤后 8 w 进行。常温,调节灯光,测试5 min,每只测试1 次,安抚大鼠使之适应环境。记录开放臂进入次数及迷宫内进行的总路程。用 Smart2郾 0 软件分析数据。于损伤后第7 周对大鼠进行水迷宫实验训练,于第 8 周测试。测试分为定位航行:4 d,从迷宫4 个象限入水,每天第 1 次训练均从目标象限对侧放入迷宫内;空间探索:3 d,取消平台,在 1郾 5 min内记录大鼠穿越平台次数。Smart2郾 0 软件分析数据。1郾 8郾 4摇 苏木素鄄伊红(HE)染色检测脊髓组织病理形态摇 取各组脊髓组织,脱蜡、水洗后,苏木素染色15 min。经酸水及氨水中分色数秒。流水冲洗后入经 70%、90%乙醇脱水。再置于伊红染色液染色2 3 min。染色后的切片经无水乙醇脱水,二甲苯透明后滴加树胶,封片固定,于光学显微镜下观察。1郾 8郾 5摇 TUNEL 检测脊髓组织神经细胞凋亡摇脊髓组织石蜡切片经二甲苯、梯度乙醇洗脱后,PBS 冲洗,置于含 2%蛋白激酶 K 消化 15 min,PBS 冲洗2 次。滴加 TUNEL 反应液,避光孵育 1 h,PBS 冲洗2 次,加入 DAPI、22%甘油缓冲液封片。荧光显微镜下观察并计算神经细胞凋亡数。1郾 8郾 6摇免疫组化检测 p鄄JAK2、p鄄STAT3 水平摇取各组大鼠脊髓组织标本,常规切片,按 SP 试剂盒说明书进行操作:烤片、脱蜡至水、高压修复、3%过氧化氢(H2O2)去离子水处理、封闭、滴加一抗过夜(p鄄JAK2 1 颐50、p鄄STAT3 1 颐100),次日滴加二抗、金黄8024中国老年学杂志 2023 年 9 月第 43 卷色葡萄球菌蛋白 A鄄辣根过氧化物酶(HRP)标记抗原工作液,二氨基联苯胺(DAB)显色,蒸馏水终止显色,PBS 冲洗,苏木素复染、冲洗、梯度酒精脱水,透明,中性树胶封片。光镜观察,以细胞质棕黄色着色为阳性细胞,取 3 个视野,分别计数每个视野的阳性细胞数,取平均值。1郾 8郾 7摇Western 印 迹 检 测 脊 髓 组 织 PI3K、p鄄PI3K、Akt、p鄄Akt 水平摇取脊髓组织,RIPA 裂解液裂解,离心。收集上清液,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量。取适量蛋白质,加入上样缓冲液,95 益 煮沸5 min,进行十二烷基硫酸钠鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS鄄PAGE)。电泳后,将分离的蛋白条带转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脱脂牛奶室温封闭 2 h 之后加入 PI3K、p鄄PI3K、Akt、p鄄Akt 一抗,4 益 孵育过夜。TBST 清洗,加入 HRP二抗,37 益 孵育 2 h鄄TBST 洗膜,加入电化学发光(ECL)液避光显影。ImageJ 图像软件分析各蛋白条带的灰度值。1郾 9摇 统计学分析摇 采用 SPSS17郾 0 软件进行单因素方差分析、t 检验。2摇 结摇 果2郾 1摇 BMSCs 鉴定结果摇 传代后的培养细胞呈旋涡状或放射状贴壁生长,细胞多呈星形、梭形或三角状,培养 3 代后,细胞贴壁加快、形态均一,呈旋涡状或单层放射状生长。见图 1。2郾 2摇 BMSCs 迁移结果摇 空白组 BMSCs 细胞迁移数量也(243郾 32 依 25郾 68)个页 显著低于含药血清组也(309郾 45依34郾 81)个页 与药物对照组也(304郾 72 依38郾 27)个页(P0郾 05)。见图 2。2郾 3摇 各组认知功能检测摇 与健康组相比,损伤组总路程、进入开臂次数、穿越平台次数显著降低,不同时间的潜伏期显著升高(P0郾 05)。与损伤组相比,干预组和对照组总路程、进入开臂次数、穿越平台次数显著升高,不同时间的潜伏期显著降低(P 0郾 05)。见表 1。图 1摇 各组 BMSCs 细胞形态(伊200)图 2摇 各组 BMSCs 迁移(结晶紫染色,伊400)表 1摇 各组认知功能对比(x依s,n=12)组别总路程(cm)进入开臂次数(次)穿越平台次数(次)潜伏期(s)1 d2 d3 d4 d健康组1 985郾 45依246郾 713郾 14依1郾 254郾 12依1郾 3710郾 24依1郾 0510郾 31依0郾 9810郾 14依1郾 2210郾 19依1郾 08损伤组724郾 36依70郾 411)2郾 03依0郾 241)2郾 56依0郾 691)52郾 41依7郾 341)51郾 65依7郾 211)52郾 46依6郾 941)51郾 04依6郾 871)干预组 1 756郾 72依217郾 481)2)2郾 64依0郾 871)2)3郾 61依0郾 821)2)36郾 47依4郾 521)2)32郾 51依4郾 141)2)29郾 62依4郾 051)2)26郾 57依4郾 111)2)对照组 1 692郾 15依252郾 371)2)2郾 56依0郾 891)2)3郾 54依0郾 911)2)37郾 55依4郾 671)2)33郾 42依4郾 051)2)30郾 12依3郾 971)2)27郾 48依3郾 741)2)F 值84郾 5003郾 1285郾 292151郾 800158郾 900175郾 500171郾 200P 值0郾 0010郾 0350郾 050郾 0010郾 0010郾 0010郾 001摇 与健康组相比:1)P0郾 05;与损伤组相比:2)P0郾 05;下表同9024宋颖军等摇补阳还五汤通过调控 PI3K/Akt、JAK2/STAT3 信号促进 BMSC 骨髓干细胞趋化迁移对外伤性脊髓损伤大鼠的神经元活性及认知功能的影响摇 第 17 期2郾 4摇HE 染色结果摇健康组脊髓组织结构完整。损伤组脊髓组织疏松水肿,有细胞空泡变性产生。相较于损伤组,干预组与对照组脊髓组织病理形态有所改善。见图 3。图 3摇 各组脊髓组织病理学形态(HE 染色,伊200)2郾 5摇 神经细胞凋亡率检测结果摇健康组脊髓组织神经细胞凋亡率也(1郾 28依0郾 64)%页显著低于损伤组也(31郾 42依4郾 97)%页(P0郾 05)。损伤组凋亡率显著高于干预组也(11郾 04依2郾 13)%页和对照组也(12郾 46依2郾 07)%页(P0郾 05)。见图 4。图 4摇 各组脊髓组织神经细胞凋亡(TUNEL 染色,伊400)2郾 6摇 p鄄JAK2、p鄄STAT3 水平检测结果摇 健康组脊髓组织中 p鄄JAK2、p鄄STAT3 阳性细胞数显著低于损伤组(P0郾 05)。损伤组 p鄄JAK2、p鄄STAT3 显著高于干预组和对照组(P0郾 05)。见表 2、图 5。2郾 7摇 PI3K、p鄄PI3K、Akt、p鄄Akt 水平检测结果摇 健康组脊髓组织中 PI3K、p鄄PI3K、Akt、p鄄Akt 水平显著高于损伤组(P0郾 05)。损伤组 PI3K、p鄄PI3K、Akt、p鄄Akt 水平显著低于干预组和对照组(P0郾 05)。见表 2、图 6。表 2摇 各组脊髓组织 p鄄JAK2、p鄄STAT3 阳性细胞数及 PI3K、p鄄PI3K、Akt、p鄄Akt 水平对比(x依s,n=12)组别p鄄JAK2(个)p鄄STAT3(个)PI3Kp鄄PI3KAktp鄄Akt健康组5郾 29依1郾 175郾 47依1郾 821郾 95依0郾 171郾 87依0郾 152郾 19依0郾 102郾 21依0郾 14损伤组26郾 47依3郾 821)29郾 45依3郾 681)0郾 71依0郾 061)0郾 62依0郾 071)0郾 64依0郾 081)0郾 58依0郾 111)干预组16郾 46依2郾 331)2)18郾 47依1郾 861)2)1郾 23依0郾 131)2)1郾 16依0郾 101)2)1郾 29依0郾 131)2)1郾 47依0郾 181)2)对照组17郾 25依2郾 171)2)19郾 52依1郾 641)2)1郾 22依0郾 121)2)1郾 14依0郾 071)2)1郾 26依0郾 091)2)1郾 45依0郾 111)2)F 值138郾 300202郾 000195郾 600299郾 000427郾 000279郾 900P 值0郾 0010郾 0010郾 0010郾 0010郾 0010郾 0010124中国老年学杂志 2023 年 9 月第 43 卷图 5摇 各组 p鄄JAK2、p鄄STAT3 阳性细胞数(免疫组化染色,伊400)图 6摇 各组 PI3K、p鄄PI3K、Akt、p鄄Akt 水平3摇 讨摇 论摇 摇 BMSCs 是一种具有良好分化能力且较容易分离获取的成体干细胞,作为种子细胞在治疗颅脑损伤和脊髓损伤方面取得了较好疗效。其治疗脊髓损伤的机制主要有作为种子细胞迁移到受损部位分化替代受损的细胞,合成分泌生长因子,如血管内皮生长因子(VEGF)、神经胶质源性神经生长因子等促进组织修复,BMSCs 还有良好的抗炎及免疫调节等功能并能够抑制小胶质细胞过度活化的能力。中医认为脊髓损伤属于督脉受损,经脉瘀阻,加之患者多因外伤而大伤元气,导致血瘀气虚之症,近年来已有研究证实也11页补阳还五汤对脊髓损伤患者具有一定的治疗作用,且补阳还五汤中当归尾具有活血祛瘀、补血通经、止痛活络等功效;赤芍具有清热凉血、化瘀等功效;桃仁具有活血化瘀、抗炎镇痛等作用。甲泼尼龙主要可以起到消炎的作用,是一种短效激素,起效快,副作用小,治疗脊髓损伤效果较好。秦丰伟等也12页运用大鼠建立脊髓损伤模型并进行的实验中,发现淫羊藿苷联合 BMSCs 通过降低脊髓损伤区域的炎症水平,改善大鼠脊髓损伤病情的严重程度。范瑜洁等也13页在对脊髓损伤大鼠的实验中提出,补阳还五汤可促进 BMSCs 增殖并向神经肝细胞方向分化。本文研究与上述研究结果相似。以往对于脊髓损伤的实验中,主要灌注的为运动、感觉功能障碍等,对于认知功能等易被忽视。已有研究证实也14页,脊髓损伤后患者会出现记忆障碍、焦虑等。本文进一步完善了脊髓损伤大鼠认知功能的行为血评价,并增加了焦虑测试,证实了大鼠在8 w后会出现学习和空间记忆能力衰减,通过高架十字迷宫实验发现,大鼠还具有抑郁、探索兴趣减退等情绪障碍。房涛等也15页通过将脑梗死患者分为对照组与观察组并运用补阳还五汤进行治疗发现,补阳还五汤可通过提高患者的血清胰岛素样生长因子(IGF)鄄1 水平,改善神经功能缺损 及 认 知 功 能。本 研 究 结 果 与 上 述 研 究相似。脊髓损伤是临床上常见的中枢神经系统疾病,致残率较高。脊髓损伤的主要病理变化是神经细胞凋亡,神经细胞凋亡以核染色质固缩、DNA断裂、电泳呈梯带分布为特征,是脊髓损伤后神经细胞死亡的主要方式。研究发现,在中枢神经系统缺血性和机械性损伤模型中,广泛存在 DNA 损伤,可表现为神经细胞凋亡、DNA 的片段化和转1124宋颖军等摇补阳还五汤通过调控 PI3K/Akt、JAK2/STAT3 信号促进 BMSC 骨髓干细胞趋化迁移对外伤性脊髓损伤大鼠的神经元活性及认知功能的影响摇 第 17 期录水平修复相关基因表达等也16页。TUNEL 可以检测细胞基因组 DNA 断裂等,从而反映细胞凋亡情况。本研究提示,补阳还五汤能够在一定程度上减弱损伤后脊髓神经元凋亡的现象,从而进行神经保护。黄芪与当归是补阳还五汤中的两味药材。李虎虎等也17页在实验中提出,黄芪具有抑制糖尿病大鼠神经细胞凋亡 的 作 用。朱 丽 娟等也18页在实验中提出,当归通过激活细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路可抑制缺血再灌注神经细胞的凋亡。本研究显示,在经过补阳还五汤药物干预后,神经细胞凋亡减少,提示其具有保护神经的作用。有研究显示也19页,神经元损伤后,可进行自我修复,但此过程需要多种基因参与调控,包括神经生长因子和凋亡相关基因等,而这些基因又受到信号转导通路的调控。研究发现也20页,PI3K/Akt 通路不仅在胰岛素调节糖代谢中发挥重要作用,还能促进神经细胞的存活和抗凋亡,并调节神经细胞的分化和运动。Akt 是 PI3K 的主要靶蛋白之一,Akt 通常磷酸化后被激活,磷酸化的Akt 可通过激活蛋白激酶 C 和线粒体 ATP 敏感性钾离子通道,改善线粒体功能,抑制线粒体释放凋亡因子,在细胞凋亡调控过程中发挥关键作用。有研究提出也21页,丹参酮域A 可能通过提高脊髓损伤大鼠脊髓组织 PI3K、Akt mRNA 和蛋白表达水平促进脊髓神经功能的 恢 复。另 研 究 表明也22页,PI3K/Akt 通路激活通过调节抗凋亡和自噬反应在脊髓损伤中起着重要的神经保护作用。Akt 磷酸化可削弱神经细胞凋亡相关下游分子的表达,如裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)鄄3、6、9,B 淋巴细胞瘤鄄2 基因(Bcl鄄2)和 Bcl鄄2 相关 X 蛋白(Bax),导致 Bcl鄄2/自噬基因苄氨素(Beclin)鄄1 复合物的解离,该过程释放 Beclin鄄1 并导致自噬反应。在吴晓光等也23页对脑出血模型大鼠的实验研究中提出,补阳还五汤通过激活 PI3K 并与其下游因子 Akt 结合,使 Akt从细胞质向细胞膜转移的同时,改变其构象,使Akt 的 Thr308 位点及 Ser473 位点发生磷酸化,活化的 Akt 通过调控 Bcl鄄2 等凋亡相关但表达的表达,从而抑制脑出血神经细胞凋亡,保护脑组织。本研究发现,在脊髓损伤中 PI3K、Akt 水平降低,经过药物干预后 PI3K、Akt 水平升高。陈博威等也24页对脑出血小鼠的实验中提出,补阳还五汤通过窖蛋白(Cav)鄄1 调控 PI3K/Akt 信号通路活性,改善病情严重程度。Qiu 等也25页针对脑出血患者的实验中提出,补阳还五汤能够激活人 CXC 趋化因子受体(CXCR)4鄄PI3K 自噬轴信号传导通路,既能够激发细胞自噬,又能够调控细胞自噬状态,实现抑制细胞凋亡的脑保护作用。本文研究与上述研究结果相似,推测补阳还五汤可能是通过促进 PI3K、Akt 激活 PI3K/Akt 通路,发挥神经保护作用,减少神经细胞凋亡,改善病情。且本文 HE 染色结果与 TUNEL 结果也可证实上述结论。近年来,国内外学者发现,JAK2/STAT3 信号转导通路在免疫系统和肿瘤相关疾病中重要作用。该通路是多种细胞因子和生长因子信号转导的共同通路,在调控细胞生物学行为中具有重要作用。脊髓损伤可激活 JAK/STAT 信号转导通路。已有研究证实也26页,脊髓损伤后 STAT3