水产品中药物残留的检测.doc

水产品中药物残留检测技术的研究进展
摘要：水产品中药物残留问题是世界各国普遍关注的食品安全热点之一，建立有效的药物残留分析方法是对水产品中药物残留进行监测和控制的前提和基础。本文结合目前国内外现有的水产品中药物残留的前处理技术和分析检测技术进行了综述，本文介绍了样品的前处理方法QuEChERS 方法、分子印迹技术和固相萃取法，分析检测技术高校液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用技术和免疫分析技术，旨在为水产品中药物残留的监测和控制提供一定的理论依据。
关键词：水产品，药物残留，检测技术
Abstract: Aquatic products in drug residue problem is the common concern of all countries in the world of one of the hotspots in food safety, establish effective drug residue analysis method is of aquatic products in drug residues of the premise and foundation of the monitoring and control. In this paper, combined with the existing water products at home and abroad in drug residues of pretreatment technology and analysis technique were reviewed. This paper introduces sample pretreatment QuEChERS method, molecular imprinting technique and solid phase extraction and analysis detection technology in liquid chromatography, high performance liquid chromatography -mass spectrometry combined with technology and immune analysis technology, and aims to provide a theoretical basis for the monitoring and control of drug residues in aquatic products.
Key words: Aquatic products; drug residue; detection technology
1.前言
我国水产品资源丰富，种类繁多，其产量多年来拘世界首位。随着近年来水产养殖业的发展，水产品在养殖过程需要使用兽药来提高产品的质量和产量，所用兽药的种类较为复杂，除了消毒剂、防腐剂，还有杀虫、驱虫类，抗生素类，磺胺类、呋喃类和喹诺酮类抗菌药等，个别情况下还会使用某些激素类的兽药[1]，违规或过量使用导致的药物残留不仅会通过环境和食物链的作用间接对人体健康造成危害，还会造成产地环境的污染，从而影响我国养殖业的发展。水产品中兽药的使用与残留越来越受到广泛的关注，已经颁布实施与水产品质量安全相关的法律法规如《渔业法》、《农产品质量安全法》、《动物防疫法》、《兽药管理条例》、《水产养殖质量安全管理规定》等为水产品质量安全提供了有力保障，除此之外，还需要准确的分析手段为法律法规的实施提供技术支撑。本文结合目前国内外现有的水产品中药物残留的前处理技术和分析检测技术进行了综述，本文介绍了样品的前处理方法QuEChERS 方法、分子印迹技术和固相萃取法，分析检测技术高校液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用技术和免疫分析技术，旨在为水产品中药物残留的监测和控制提供一定的理论依据。
2.水产品中药物残留的前处理方法
2. 1 QuEChERS 方法
QuEChERS 是“快速、简单、廉价、高效、耐受、安全”这几组词的首字母组合。QuEChERS 技术是一种兼具上述特性且已被普遍认同的一种样品前处理技术。QuEChERS 技术目前常用于疏水性农药残留检测以及兽药残留检测的前处理制备[2-5]。QuEChERS 方法可简单归纳为4 步: ①单一的乙腈缓冲液浸提样品; ②加入MgSO4 等盐类除水, 乙腈层分离; ③加入乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine,PSA)等吸附剂除杂; ④分离上清液进行气相色谱(GC)、气质联用(GC-MS)、液相色谱(LC)和液质联用(LC-MS)检测分析。QuEChERS自发布以来，因其简化了以前繁杂的萃取步骤并扩大了所萃取农药残留的范围，被包括美国官定分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)在内的多个国际农药残留分析机构广泛采纳，并在农药残留领域获得了大量的应用。
杨金易等[6]将QuEChERS方法应用于检测喹诺酮类药物多残留的ELISA样品的前处理与测定，首次建立了QuEChERS-ELISA快速测定水产品中喹诺酮类药物多残留的方法，该方法批内回收率为86.32%-101.89%，批间回收率86.15%-102.75%，可以满足水产品中喹诺酮类药物的实际检测需求。Villar-Pulido 等[7]采用QuEChERS 和液相与飞行时间质谱LC-TOF-MS 联用的方法分析虾中的13种常用抗生素和兽药。其对比4种样品处理方法， 包括两种SPE 方法、MSPD 方法和QuEChERS 方法。样品经两种SPE 方法处理后，萃取液较浑浊；经MSPD 处理后得到澄清萃取液，但分析物的回收率较低，大多数低于40%，而QuEChERS 方法处理，可以排除基质干扰，回收率58%～133%，且检测限0.06～7 μg/kg。用该方法成功分析了12种虾样，可用于虾中这些分析物的超痕量检测。VILLAR-PULIDO等[8]在测试虾中孔雀石绿、甲苯咪唑、磺胺7类、甲氧苄啶等时使用1%乙酸乙腈作为萃取剂，使用PSA和MgSO4作为净化剂，最终测得检出限为0.06-7g/kg。
2.2分子印迹技术
分子印迹技术是为获得在空间结构和结合位点上某一分子完全匹配的聚合物的实验制备技术, 是结合高分子化学、生物学等学科发展起来的一门边缘学科。1942 年Dickey 首次提出“分子印迹”概念, 直到1972 年分子印迹聚合物首次人工合成后,这项技术才逐渐为人们认识, 并与近十年内得到飞速发展。分子印迹聚合物(molecular imprinted polymer, MIP)可在分子水平上对物质进行选择性识别, 类似于酶和底物、抗体和抗原的关系, 对特定分子具有特异的选择性, 且具有生物活性物质无法比拟的稳定性, 对加热、有机溶剂及强酸强碱等稳定等优点。分子印迹固相萃取(molecularlyimprinted solid phase extraction, MISPE)已成为固相萃取研究的热点之一。

分子印迹技术可用于药物、激素、蛋白质、农药等的测定。Cacha[9]等以丙烯酸甲酯扑灭津为模板分子利用沉淀聚合法制备了一种搬共价分子印迹聚合物，结合高效液相色谱技术建立了针对土壤和植物样品中三嗦类除草剂的测定方法。Li 等[10]采用同样的材料合成了孔雀石绿分子印迹聚合物, 分析了自来水、鱼塘水和观赏鱼池水中的孔雀石绿，隐色孔雀石绿和结晶紫成分。Ferrer 等[11]首次用 off-line MISPE 从地下水和沉积物样品中萃取分析了六种氯三嗪物质，他们制备了叔丁基吖嗪分子印迹聚合物，用二氯甲烷淋洗干扰介质，待测物的回收率大于 80%。Curcio 等[12]利用 off-line MISPE 从被污染的食品中分析三聚氰胺，日间和日内精度分别为 2.7% - 4.3% 和7.2%- 9.4%。
2.3固相萃取法
固相萃取法(solid phase extraction, SPE)是利用固体吸附剂将液体样品的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，再用洗脱液洗脱达到分离和富集目标化合物的目的。固相萃取的操作步骤主要包括柱的预处理（活化）、加样、柱的洗涤、柱的干燥、分析物的洗脱五个步骤。具有回收率和富集倍数高、有机溶剂用量少、对环境友好、无相分离操作、易于收集组分、能处理小体积试样、操作简单和易于实现自动化等优点, 在农兽药残留分析中有着广泛的应用,多变的填料结合适当的溶液条件,适用于不同化学性质的农兽药提取和净化。
水产品兽药残留检测中常用固相萃取柱有C18柱、离子交换柱、氧化铝柱、硅藻土柱、高分子聚合物柱等[13-18]。任慧丽[19]等用强阳离子交换柱固相萃取净化测定了水产品中泰乐菌素药物残留，获得了较好的灵敏度和重复性。李春凤[20]等用HLB固相萃取柱净化，测定了水产品中氯丙嗪、乙酰丙嗪、丙酰丙嗪、异丙嗪、甲苯噻嗪等5种吩噻嗪类药物，平均回收率75.7~87.7%，整体净化效果较好。Yi Yang等[21]在LC-MS/MS测定50种激素的多残留方法中使用碳黑固相萃取柱和氨基固相萃取柱联用净化样品，获得了较好的效果，方法检出限在0.04~8.13μg/kg，50种激素残留回收率为76.9-121.3%。
3.水产品中药物残留的检测技术
3.1高效液相色谱
高效液相色谱法，又称高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱、高分离度液相色谱，是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术。随着HPLC不断地改进与发展，目前作为一种成熟稳定的检测方法已广泛用于药物残留分析。高校液相色谱以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
高效液相色谱法作为水产品中兽药残留检测最常用的检测方法目前大量的国家和行业标准均采用了此方法。经典的标准方法包括《GB/T20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》、《农业部958号公告-12-2007 水产品中磺胺类药物残留量的测定》、《农业部783号公告-2-2006 水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的测定》、《农业部1077号公告-2-2008 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定》、《SC/T3015-2002 水产品中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定》、《SC/T3029-1006 水产品中甲基睾酮残留量的测定》等。
金高娃等[22]使用超高效液相色谱法测定海水鱼、淡水鱼、虾、蟹及贝等在内的７０余种水产品中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星等３种喹诺酮类药物残留量，测得恩诺沙星量为1.98μg/kg -1。孟勇等[23]采用高效液相色谱法同时测定水产品中呋喃唑酮、噁喹酸、萘啶酸及４种磺胺类药物等７种兽药残留量，样品经乙腈提取，正己烷脱脂，用中性氧化铝柱和C18固相萃取柱进行分离及净化，７种兽药的质量浓度与其峰面积均在0.05-1.0mg/L范围内呈线性关系，检出限（3S/N）为0.01-0.04mg/kg。方法的回收率在68.2%-97.3%之间。高校液相色谱可以用在测定孔雀石绿、磺胺类、喹乙醇、四环素类（土霉素、四环素和金霉素等、硝基呋喃类药物、喹诺酮类药物等，检测灵敏度可达到μg/kg级别。
3.2高效液相色谱-质谱联用技术
高效液相色谱-串联质谱法是一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的方法，对高沸点、不挥发和热不稳定化合物的分离和鉴定具有独特优势，成为近年来药物残留分析中一种重要的检测技术。高效液相色谱-质谱联用仪主要由液相色谱系统和质谱系统两部分组成，样品由液相系统进入，经色谱柱分离，被分离的组分依次进入质谱系统，在离子源中离子化，离子聚焦于质量分析器中，根据质荷比而分离，分离后的离子信号转化为电信号，传递至计算机数据处理系统，根据质谱峰的强度和位置对样品的成分和结构进行分析[24]。
在水产品药物残留检测领域，高效液相色谱-串联质谱检测方法具有以下优势：①样品预处理过程简单，样品用量较少；②可同时测定多种组分，有利于实现多残留检测；③一般样品无需衍生化，简化了操作步骤；④检测灵敏度高，通常比其他检测器高10~100倍。现行水产品中药物残留检测的国家、行业标准方法有许多是高效液相色谱-串联质谱法，代表性的方法有《农业部783号公告-1-2006 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定》、《GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》、《农业部1077号公告-1-2008 水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定》、《GB/T 20756-2006 可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定》、《农业部1077号公告-6-2008 水产品中玉米赤霉醇类残留量的测定》等。
黄德凤等[25]针对水产品中磺胺类药物的多残留问题而建立的同时测定水产品中19种磺胺类药物残留的高效液相色谱-串联质谱法方法，通过梯度洗脱，将具有相同定性离子的磺胺良好分离，方法简便、快速，回收率为80%-105%，适用于批量样品的检测。李向军等[26]建立的同时测定24种性激素的高效液相色谱-串联质谱法，实现了3类性激素的同时定量及定性确证分析。万译文等[27]建立的水产品中12种喹诺酮类和磺胺类药物残留量同时测定的方法，其检出限为1.0μg／kg，定量限为2.0μg／kg，回收率达到69.5%-121.9%，具有较高的重现性和选择性。罗辉泰等[28]建立的高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中四环素类、喹诺酮类、磺胺类、磺胺增效剂和三苯甲烷类共5大类33种药物残留的方法，目标药物在相应的浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.99，在3个不同浓度添加水平下，平均回收率为63.6%～115.2%。
3.3免疫分析
免疫分析法是几年发展起来，以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的新型分析技术。作为相对独立的检测方法，即基于竞争结合分析原理的免疫测定法，包括酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、胶体金免疫渗滤法等。目前使用普遍的是酶联免疫吸附法，其测定原理是将已知的抗体或抗原结合在某种固定载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。然后洗涤分离抗原抗体复合物和游离成分。最后加入酶的作用底物催化显色，利用酶标仪进行定性或定量测定。水产品药残免疫分析检测中较为成熟的方法是酶联免疫法，水产品中氯霉素、乙烯雌酚等参数已经建立了酶联免疫测定的标准方法，用于大量样品的筛选检测。行业中常用的标准方法有《SCT3020-2004 水产品中乙烯雌酚残留量的测定》、《NY5070-2002 无公害食品 水产品中渔药残留限量》附录A中的“氯霉素残留的酶联免疫测定”。
有关研究人员[29]采用双抗夹心酶联免疫吸附法来检测患病刺参体内的黄海西瓦氏菌，利用该方法对刺参体壁匀浆上清液进行检测，灵敏度达到 1.0×106 cfu/m L，特异性强，与爱德华氏菌、弧菌、气单胞菌、大肠杆菌等致病菌株均无交叉反应。另有研究[30]以引起大菱鲆患病的迟缓氏爱德华菌为研究对象，采用间接 ELISA 对其肌肉组织匀浆上清液进行检测，上清液包被微孔板，依次加入兔抗、酶标二抗，使其发生免疫反应后记录并处理数据，该方法能够较快速、灵敏地将致病菌检测出来，与其它致病菌株均无交叉反应，从养殖场发病的大菱鲆和半滑舌鳎分离出 56 株细菌菌株后，运用该方法进行检测，检测结果令人满意。该方法为快速诊断迟缓氏爱德华菌引起的鱼类疾病提供了理论依据。
4.展望
水产品中药物残留问题是世界各国普遍关注的食品安全热点之一，建立有效的药物残留分析方法是对水产品中药物残留进行监测和控制的前提和基础。由于水产品基质复杂性和水产品养殖用药的特殊性，使水产品药物残留检测存在一些困难和问题。近年来，随着我国沿海区域经济的飞速发展，大量的废水、废弃物和有毒物质等被排放到海洋环境中，这些污染物不仅直接对海洋环境及生态平衡造成了破坏，而且有些有毒污染物通过生物富集与食物链传递，影响和危害人类自身的健康。因此对海洋环境中有机污染物进行监测，对于了解海域污染状况，指导海域管理具有重要的现实意义。
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