电泳方法实例.doc

 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳及其定量
一、目的
1 ．了解电泳分离蛋白质的基本原理。
2 ．掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的方法。
二、实验原理
    带电粒子在电场中向与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。电泳技术被广泛用于蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定，电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的粘度等有关。其中粒子荷电量又受周围介质的pH和离子强度的影响；电场强度则取决于电泳时所加的电压。根据支持物的种类及操作方式的不同，可将电泳分为许多种类，如滤纸电泳，醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳，淀粉颗粒或聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
    本实验采用醋酸纤维薄膜为固相支持物。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿。氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干糙后就成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，制成厚度约为120?m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。
    血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH值7.3。它们在pH值8.6的缓冲液中均解离带负电荷，电泳移向正极。由于血清中各种蛋白质的分子大小、形状及所带电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为：清蛋白及?1球蛋白、?2球蛋白、?球蛋白、?球蛋白等5条区带。薄膜置于染色液中使蛋白质固定并染色后，不仅可看到清晰的色带，并可将色带染料分别溶于碱溶液中进行定量测定，从而可计算出血清中各种蛋白质的百分含量。肝硬化时清蛋白显著降低，?球蛋白升高2～3倍；肾病综合症时清蛋白降低，?2和 ?球蛋白升高。
几种血清蛋白质的等电点、平均相对分子量、电泳区带及正常含量

三．实验材料
1．器材
①电泳仪：0～500V，0～100mA，电泳槽（×1）；

②醋酸纤维素薄膜（1.5～2×8cm，×2）；
③小试管（×1），培养皿（×3），载玻片（×1），玻璃管平衡桥，玻璃片（4×10cm，×1）；
④剪刀（×1）,平头镊子（×2），电吹风（×1）；
⑤721或722型分光光度计。

2．试剂
（1） 巴比妥缓冲液（pH值为8.6，离子强度0.06）：巴比妥钠（C.P.）12.7g，巴比妥（C.P.）1.66g，置于盛有约200mL蒸馏水的烧杯中稍加热溶解，待冷到室温，用蒸馏水稀释到1L。
（2） 染色液：氨基黑10B 0.5g，加甲醇（C.P.）50mL，冰醋酸10mL，加蒸馏水到100mL，溶后备用。
（3） 漂洗液：16.50mol/L乙醇（医用）45mL，冰醋酸（C.P.）5mL ，加蒸馏水到100mL，混匀。
（4） 洗脱液：0.4mol/LNaOH溶液
（5） 透明液：冰醋酸（C.P.）25mL，加16.50mol/L(95%)乙醇（医用）75mL，混匀。
（6） 新鲜血清（无溶血

四．实验操作
1． 薄膜准备
     将醋酸纤维素薄膜切成8×2 cm条状（根据需要决定薄膜大小），在薄膜粗面一端1.5cm处用铅笔轻轻画一条横线（点样线），末端旁用铅笔作一标记。浸入巴比妥缓冲液中至完全浸泡均匀（浸泡所需时间随出厂质量而异，一般需浸泡20min或更长时间）。用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸之间，轻轻按压，吸去多余的液体。
2． 点样 把薄膜放在干糙的滤纸上。
     用较尖的血色素吸管或其它点样管吸取样品2～3?L（血清、纯化的清蛋白或?-球蛋白液等样品，若该样品液年度较稀时，要适当增加用量），涂在玻片的一端截面上（玻璃宽度应小于薄膜宽度），或用载玻片一端的截面在盛有样品的平皿内直接沾上2～3?L样品，然后将沾有样品的玻片截面于醋酸纤维素薄膜点样线轻轻地接触，平即呈一条线“印”在薄膜上，使样品尽量点得细窄而均匀，如图1（醋酸纤维素薄膜规格及点样位置）。点样量不宜太多，也不宜太少，这步是电泳的关键步骤。
3． 电泳

     已点好样品的薄膜架在铺有滤纸盐桥的电泳槽上，使薄膜粗面向下，点样端置阴极，膜应轻轻拉平，如图2（电泳槽剖面图）。 电泳槽加盖密封，以使蒸汽饱和，避免水分蒸发。平衡约5min，使薄膜渗透的缓冲液达到平衡。检查电泳装置线路是否正确，然后通电。调节电流强度为0.4~0.6mA/cm膜宽（有数条膜，便求数条膜宽的总和），或调节电压为10/cm膜长（薄膜的有效长度是两电极缓冲液面之间滤纸盐桥和薄膜的长度之和），数条并列的薄膜只要其中之一条即可。当蛋白（仔细观察可见淡黄色）移动约5cm即可切断电源停止电泳，一般通电40～60min。

4． 染色和漂洗
     电泳结束，取下薄膜，立即浸入染色液中5min。取出，尽量沥尽染色液，移入漂洗液中漂洗脱色，每隔5min换一次漂洗液，直至薄膜底色洗净为止（一般更换2～3次），用滤纸吸干，一般可显5条区带。从正极端起，依次为清蛋白、?1、?2、?、?球蛋白，如图3（血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳图谱）。
5． 薄膜透明
     将漂洗干净的薄膜完全干糙后（可用电吹风吹干），浸入透明液中20min后，取出平贴在玻璃板上（不需要留有气泡），完全干糙后即成为透明的薄膜图谱，可作扫描或照相用。如将该玻璃板浸入水中，则透明的薄膜可脱下，吸干水分，可长期保存。
6． 定量
     未经透明处理的电泳图谱，可直接用于定量测定，一般采用洗脱法或光密度计法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。
1． 洗脱法：
     取漂洗好的薄膜用滤纸吸干后，剪下各蛋白质区带，分别放进试管内，编号，各管加入0.4mol/LnaOH 5mL，反复振摇使其充分洗脱。在无蛋白质区带处剪相同大小的薄膜以同样方式洗脱作为空白液。洗脱液用721型或722型分光光度计，在620nm波长处测定，用空白液调零，测定各管的吸光度值，结果按下式计算：
2． 光密度计法：
     将干糙的蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳图谱放入自动扫描光密度仪（或色谱扫描仪）内，通过反射（用未透明薄膜）或透射（用已透明的薄膜）方式，在记录器上自动绘出蛋白质组分曲线图，横坐标为膜的长度，纵坐标为光密度（或光强度），每一个峰代表一种蛋白质组分。然后用求积仪测量出各峰的面积，计算每个峰的面积与它们的总面积的百分比就代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。在用具有电子计算机附件的自动扫描光密度仪时，可以从数字显示部分或打字带上直接获得每条区带蛋白质的百分含量。

五．注意事项
（1） 醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用同一批号、薄膜厚度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。
（2） 血清或其它电泳样品应新鲜。
（3） 点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样位置要合适。
（4） 滤纸盐桥要置平整，保证电场均匀。
（5） 电泳槽盖要密封，盖内空间不宜过大。
（6） 较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不宜过高。
（7） 选择合适的缓冲液离子强度。离子强度低（小于时），电泳速度快，但分辨率较差，缓冲液也容易改变；离子强度高时，电泳速度慢，所需电泳时间长，但区带分辨较好（大于会使区带过于紧密）。一般气温低时可采用较高离子强度；气温高时宜选用较低离子强度，否则薄膜上局部发热、水分蒸发过多，得不到良好图谱。
（8） 两电泳槽内缓冲液面应在同一水平面，否则会因虹吸影响电泳效果。
（9） 要控制好电流、电压和电泳时间。电泳高，电流大，电泳快，电泳时间可以缩短，但产热多，薄膜上水分蒸发也多，严重时会使图谱短而不清晰；相反，电流、电压过小时，电泳所需时间过长，由于样品的扩散也不能获得良好的图谱。一般气温低时可用较大的电流、电压。气温高时则宜用较低的电流、电压。
（10） 电泳槽内缓冲液可以多次使用，但两极溶液要交替使用，最好将连接正极、负极的线路调换使用。操作时应尽量减少缓冲液的污染、水分蒸发、及离子强度的改变，并应防止霉菌的滋长。如电泳缓冲液受污染，或其、浓度显著发生变化、霉菌滋长、电泳得不到满意结果，就应更换。
（11） 染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性良好的定量结果。
六．复习思考题
1． 以醋酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？
2． 肾病综合症、慢性肝炎及肝硬化患者的血清蛋白电泳结果可能出现怎样的改变？
3． 在本实验电泳过程中，正负电极各发生什么反应?电极附近的缓冲液有什么变化?